泪腺肿瘤组织中GPX3基因mRNA和蛋白的表达及其相关性

邢其棋 刘冬冬 于丹阳

【摘 要】目的：对GPX3基因mRNA和蛋白在泪腺上皮性肿瘤中的表达及其相关性进行分析探讨。方法：采用逆转录-多聚酶链反应和蛋白质印迹法（免疫印迹试验），对2016年1月～2018年1月间来我院治疗的泪腺多形性腺瘤（20例），泪腺腺样囊性癌（15例）及正常泪腺组织（5例）共40例，对其中的谷胱甘肽过氧化物酶3（GPx3）基因mRNA及蛋白的表达进行检测。结果：反转录·聚合酶链反应结果显示，GPX3 mRNA在正常泪腺组织表达量为0.89±0.02，在泪腺多形性腺瘤表达量为0.52±0.02，在泪腺腺样囊性癌中的表达量为0.23±0.01，差异具有统计学意义（P<0.05）。蛋白质印迹法结果显示，GPX3蛋白在正常泪腺组织中的表达为1988.00±120.03，在泪腺多形性腺瘤中的表达为760.01±120.30在泪腺腺样囊性癌中的表达为0，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：泪腺肿瘤的产生和发展过程中可能有GPX3的参与，GPX3可作为一种辅助分子标记物用以鉴定泪腺肿瘤的良性及恶性。

【关键词】泪腺肿瘤；GPX3基因；蛋白质印迹法；相关性

泪腺肿块在临床上较为多见，占眼眶肿瘤的13%左右，其中最为常见的为泪腺混合瘤，泪腺肿瘤的发生和发展是一个具有复杂性的过程，它和多种基因功能的改变有密不可分的关系，它是一个癌基因的激活和抑癌基因的失活步骤。GPX3是近年来在临床上发现的抑制癌细胞作用的基因之一，是GPXs家族中的成员，在临床恶性肿瘤的病患中低表达，但在泪腺肿瘤组织中，对GPX3基因mRNA和蛋白的表达及其相关性的相关分析研究较少，因此，本研究从mRNA及蛋白水平检测GPX3基因在120例泪腺多形性腺瘤，泪腺腺样囊性癌及正常泪腺组织中的表达进行分析研究，并对其表达和泪腺肿瘤发生与发展是否有相关性进行探讨。

1 材料与方法

1.1 基本材料

采用逆转录-多聚酶链反应和蛋白质印迹法（免疫印迹试验），2016年1月～2018年1月间来我院治疗的40例眼科手术病患，根据病患的病理检查结果，根据随机分组的原则，分为泪腺多形性腺瘤（良性肿瘤20例），泪腺腺样囊性癌（恶性肿瘤15例）及正常泪腺组织（开放性眼眶损伤5例）三组共40例，对其中的谷胱甘肽过氧化物酶3（glutathione peroxidase 3，GPx3）基因mRNA及蛋白的表達进行检测。其中男22例，年龄22～72岁，平均年龄（35+12.2岁）。女18例，年龄28～70岁，平均年龄（40+12.2岁）

纳入标准：（1）所有病患术前均未接受化学治疗和放射治疗（2）病患所取标本立刻用液氮冻存，并于零下80℃的条件下进行存储。（3）病患均签署知情同意书。

排出标准：（1）经过化疗或放疗的病患。

1.2主要试剂

（1）RNA试剂及RT—PCR反应试剂.（2）抗GPX3兔抗人单克隆抗体。（3）辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（4）鼠抗人内参B—actin一抗

1.3 方法

1.3.1 逆转录PCR技术检测GPX3的mRNA表达

取病患50mg组织，应用Trizol试剂进行组织中RNA的提取，经Nano-drop分光光度计进行浓度和纯度的检测。取2ug总RNA，根据相关说明逆转合成cDNA。之后进行聚合酶链式反应扩增，聚合酶链式反应体系为：cDNA l uL，聚合酶式反应混合物9.5μL，上下游引物各1μL，双蒸水补至25μL。GPX3引物序列：上游5-TAGGGAGCCCTCAC CATTGAT-3，下游5-CTGAGTTCACTCCTGGTTCCT-3。β-ac-tin引物序列：上游5-CACGATGGAGGGGCCG-GACTCATC.3，下游5-TAAAGACCTCTATGC-CAGT.3。循环参数：94℃/4 min，94℃/l min，55℃/1 min，72℃/1 min，35个循环，72℃终延伸7min。取PCR产物5μL，20g·L-1。1琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下进行观察并拍照。应用去离子水进行阴性对照。通过Quantity-one软件，进行每个样本的GPX3表达水平的计算，表达量相对值=待测基因扩增条带的灰度值/13-actin基因扩增条带的灰度值。

1.3.2 蛋白质印迹法检测GPX3的蛋白表达

取病患30μg组织总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳80V，待蛋白至分离胶后120 V。湿转220 mA，2h后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。首先，取50g·L-1脱脂奶粉进行lh的封闭后加入l：1000的l×TBS稀释的一抗GPX3，保持在4℃保存至过夜，进行洗膜3次/10min。之后，加入l：3000的l×TBS稀释的二抗，室温下静置1h后洗膜3次/10 min。再次，加入l：1000的l×TBS稀释的鼠抗人内参B-actin一抗，保持4℃储存至过夜，进行洗膜3次/10 min。最后，加入1：3000的l×TBS稀释的二抗，在室温下静置lh后进行洗膜3次/10min。最终在暗室状态下加入ECL发光剂进行曝光显影。应用软件Quantity-one机型各个样本GPX3蛋白表达水平的计算。

1.4 统计学处理

进行计数资料的统计，应用FisherS精确检验法进行三组间的比对，其次采用χ2检验GPX3在不同性别，年龄和肿瘤大小间在泪腺上皮性肿瘤中的表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。最后使用统计学SPSS21.0的软件进行统计和对比分析。

2 结果

2.1正常泪腺组织与良性泪腺肿瘤及恶性泪腺肿瘤组织中GPX3 mRNA的表达

正常泪腺组织中GPX3mRNA表达量显著高于泪腺多形性腺瘤，差异具有统计学意义（P<0.05），详情见图一；正常泪腺组织与泪腺腺样囊性癌GPX3 mRNA的转录结果详情见表一。

2.2 正常泪腺组织与良性泪腺肿瘤和恶性泪腺肿瘤组织中GPX3蛋白的表达

蛋白质印迹法结果显示，GPX3蛋白在正常泪腺组织和良，恶性泪腺肿瘤组织中的表达分别为1988.00±120.03，760.01±120.30，0，差异具有统计学意义（P<0.05），详情见表二。GPX3蛋白表达量在正常泪腺组织中较泪腺多形性腺瘤高，差异具有统计学意义（P<0.05），详情见图二。

3 讨论

肿瘤的发生至发展至恶变过程是由于多种因素造成的，它是经多个阶段和步骤的基因发生改变的过程。而眼眶内多发的肿瘤之一就是泪腺上皮性肿瘤，其良性肿瘤的恶变率较高，而恶性肿瘤的死亡率和复发率更高。所以，研究泪腺良性肿瘤和恶性肿瘤的发生发展及侵袭的生物学指标转移过程，在临床上具有重要含义。因为病患体内活性氧簇的平衡是决定细胞命运的关键，而癌细胞的特点是活性氧的清除能力下降，但是活性氧簇的产量大量增加，而活性氧簇可以起到抑制凋亡的作用，而很多类型的酶例如超氧化物歧化酶，GPX和抗氧化物的过氧化氢酶可以起到中和活性氧簇的酶类作用下降的作用。GPX3基因主要位于在肿瘤中常见的染色体杂合性缺失位点5q23，其主要合成部分是肾脏的近端小管，它是一种典型性的前导序列的胞外酶。它被认为具有抑制癌细胞基因活性的作用。

本研究结果显示，正常泪腺组织中GPX3mRNA表达量显著高于泪腺多形性腺瘤，差异具有统计学意义（P<0.05）。说明泪腺肿瘤的产生和发展过程中可能有GPX3的参与。

综上所述，GPX3蛋白表达参与了恶性泪腺组织的发生和发展，在临床中对GPX3蛋白进行检测，有利于进行临床泪腺肿瘤的早期诊断和愈后判断。

参考文献：

[1]郭素珍，宋国祥.泪腺上皮性肿瘤临床及病理学研究进展[J]眼科新进展，2010，21（2）：138～140.

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