组织工程化干细胞联合PRP在骨不连中的临床应用

赵宝平 叶川 江深河 武成兴 谢大伟 李江龙 刘志伟 许明友 付红军

摘 要：目的 比较骨不连患者采用组织工程干细胞联合PRP和常规开放固定+有效植骨治疗的临床疗效。方法 将骨不连患者43例分为治疗组22例和对照组21例，治疗组患者采用组织工程化干细胞联合PRP移植治疗，对照组采用开放内固定+有效植骨治疗。比较患者两组手术时间、出血量、住院费用、住院时间、切口愈合等级、有无取自体骨等相关指标。结果 随访9～15个月后，治疗组骨折愈合率为86.36%，对照组骨折愈合率为85.70%，组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在手术时间、出血量、住院费用、住院时间方面，对照组均高于治疗组，差异有统计学意义（P<0.05）；切口愈合方面，对照组有2例患者出现Ⅱ级愈合，治疗组患者均为Ⅰ级愈合；有无取自体骨：治疗组无一例取自体骨，对照组均取自体骨。结论 组织工程化干细胞联合PRP可作为一种有效的治疗骨不连的方法，较常规手术方法更微创，操作更简便，损伤小，节约经济，减少住院时间，未来可作为治疗骨不连的一种有效的方法。

关键词：组织工程；间充质干细胞；富含血小板血浆；骨不连

中图分类号：R687.3 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.12.020

文章编号：1006-1959（2018）12-0065-04

Abstract：Objective To compare the clinical efficacy of tissue-engineered stem cells combined with PRP and conventional open fixation+effective bone grafting in patients with non-union.Methods 43 patients with nonunion were divided into treatment group（22 cases）and control group（21 cases）.The treatment group patients were treated with tissue-engineered stem cells combined with PRP transplantation，and the control group was treated with open internal fixation+effective bone grafting.The two groups of patients were compared for operative time，blood loss，hospitalization costs，length of stay，incision healing grade，and whether autologous bone was taken or not.Results After 9 to 15 months of follow-up，the fracture healing rate was 86.36% in the treatment group and 85.70% in the control group.There was no significant difference between the two groups（P>0.05）；The operative time，blood loss，hospitalization costs，and length of hospital stay were higher in the control group than in the treatment group，the difference was statistically significant （P<0.05）.In wound healing，two patients in the control group had grade II healing，and all patients in the treatment group had grade I healing；Whether or not autologous bone was taken：No autologous bone was used in the treatment group，and autologous bone was used in the control group.Conclusion Tissue-engineered stem cells combined with PRP can be used as an effective method for the treatment of bone non-union，which is more minimally invasive，easier to operate，less damaged，economical，and less time spent in hospital.The future can be used as an effective treatment for non-union.

Key words：Tissue-engineered；Mesenchymal stem cells；Platelet-rich plasma；Non-union

骨不連一直以来是困扰骨科医师的难题[1]，临床上常见的方法是开放手术，取自体骨或同时更换内固定方式[2]，因其手术创伤较大，出血较多，费用高，取自体骨骨副损伤等，一直不被患者所接受。近年来随着干细胞、生物材料学及组织工程技术的发展，使干细胞和PRP（platelet-rich plasma）移植治疗骨不连的研究逐渐成为骨科领域研究的热点[3]。既往都采用单一方法治疗骨不连，效果较好但仍存在失败病例，间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力、PRP中的TGF因子家族有促进干细胞成骨转化和局部血管化的生物学效应，如能联合二者对骨不连进行治疗，理论上有增加疗效的功能，且在本研究中我们使血浆成分凝胶化，使血浆转换为可吸收生物材料而负载干细胞和PRP中的生长因子成分，形成组织工程化干细胞-PRP凝胶，避免了局部注入的干细胞和PRP流失的弊端，固化和增加了二者在局部发挥更大的生物学效应，文章总结兴义市人民医院骨创伤科近4年来组织工程化干细胞联合PRP治疗骨不连的手术，比较了两种手术的临床疗效及相关指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集兴义市人民医院于2013年3月～2017年6月因骨不连行手术治疗的患者43例，本实验采用非随机同期对比观察，已获得兴义市人民医院伦理委员会的批准。根据手术方法将所有患者分为治疗组和对照组。治疗组22例，男17例，女5例，年龄19～65岁，平均年龄（42.50±1.11）岁；BMI 20.20～25.11 kg/m2，平均BMI（24.30±1.01）kg/m2。对照组21例，男16例，女5例，年龄20～57岁，平均年龄（40.50±1.11）岁；BMI 21.61～26.30 kg/m2，平均BMI（23.66±1.01）kg/m2。两组患者性别、年龄、BMI等一般资料相比，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2诊断、纳入和排除标准

1.2.1诊断标准 参照文献[4]，根据患者的临床及影像学指标诊断骨不连。

1.2.2纳入标准 ①符合诊断标准；②排除感染性骨不连；③患者同意行该手术方案。

1.2.3排除标准 ①感染性骨不连；②下肢血管性疾病；③局部皮肤条件不允许[5]。

1.3方法

1.3.1材料 ①治疗组：离心机（实验室医用离心机80-1），离心管（50 ml），凝血酶（500 U/支），穿刺针。②对照组：锁定钛板（北京富乐科技开发有限公司），髓内钉（苏州康力骨科器械有限公司），辅助工具为不锈钢。

1.3.2术前准备 所有患者入院后行全面的体格检查和辅助检查，评估手术耐受情况，血压控制在150/90 mmHg以下，血糖8.0 mmol以下，CRP 10 mg/L以下，ESR 20 mm/h以下。

1.3.3手术方法 治疗组行组织工程化干细胞联合PRP治疗，原内固定不更换。间充質干细胞采集方法：重组人粒细胞集落刺激因子，予患者400 μg/d皮下注射，1次/d，连用4 d。检查外周血白细胞计数，使外周血白细胞计数控制在（3～4）×1010/L。监测白细胞变化，当白细胞升至平均20～250倍时，应用血细胞分离机循环全省血液分离出浓度为（1～3）×1011/L的外周血干细胞悬液，离心待用。PRP采用二次离心分离技术，取中层血小板富集区待用[6]。同法取髂前上棘为穿刺点，抽取取骨髓血50 ml，应用血细胞分离机分离出浓度为（1～3）×1011/L的骨髓干细胞悬液，离心待用。 干细胞悬液和PRP混合后共10 ml，混匀后加入凝血酶适量，按照（1 ml∶100 U），制成凝胶待用。根据患者骨不连的特征，对于肥大型的采用X线下定位穿刺骨折断端，细小刮匙刮除创面硬化骨，多点注入骨折断端，有效的外固定。对萎缩性骨不连及滑膜性假关节采用小切口切开骨折断端纤维清理，骨折复位后将制备好的凝胶样物放入骨折断端，关闭伤口，对骨折做有效的固定。

对照组行开放手术更换内固定+自体骨植骨治疗。取同侧髂骨松质骨适量备用，沿原切口进入，显露清理骨折断端，更换内固定，将备用的松质骨打压植入骨折端，放置引流，关闭切口。手术后根据固定可靠程度及部位在患者可耐受情况下决定开始功能锻炼时间。

1.3.4术后处理 术后预防性抗生素治疗3 d，对照组中引流管24 h后拔除，出院1、3、6、12、15个月复查，根据复查结果指导功能锻炼、负重和拆除内固定时间。

1.4观察指标 参照文献[6]，根据患者的症状体征及影像学指标诊断骨愈合，根据骨折愈合标准统计骨折愈合率，手术时间（h），出血量（ml），住院费用（元），住院时间（d），切口愈合等级，有无取自体骨。

1.5统计学分析 采用SPSS12.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，组间数据差异的比较采用配对t检验，计数资料以（%）表示，比较采用？字2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者各项观察指标比较 所有患者均获得随访，随访6～15个月，治疗组愈合率86.36%，有1例出现了骨延迟愈合，通过连续随访，12个月获得了骨愈合。对照组骨折愈合率85.70%，组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），在手术时间、出血量、住院费用、住院时间方面，对照组均高于治疗组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1；切口愈合方面，对照组有2例患者出现Ⅱ级愈合，治疗组患者均为Ⅰ级愈合；有无取自体骨：治疗组无一例取自体骨，对照组均取自体骨。

2.2典型病例 图1中a、b、e、f为治疗组术前骨不愈合的正侧位片，c、d、j、k为采用组织工程化间充质干细胞联合PRP治疗后6月正侧位片，i、m为对照组术前的骨不愈合的正侧位片，n、o为采用开放固定+有效植骨治疗6个月后正侧位片。

3 讨论

从以上实验我们可以看到，组织工程化干细胞联合PRP在治疗骨不连中有优越的效果，在保证骨折愈合率的基础上，较我们传统手术创伤小，出血少，减少了住院时间及住院费用，减少取自体骨带来的副损伤，伤口愈合好，是一种值得推广的治疗骨不连的方法。

骨不连通常被分为肥大性，骨膜性假关节，感染性，萎缩性骨不连等四种，肥大性骨不连局部血供较好，引起骨不连的原因主要是局部不稳，影像学表现“象足征”或“抱球状改变”。需牢固的内固定一般可达到骨性愈合。滑膜性假关节是在骨折处形成一个充满液体的滑囊腔，封闭了骨髓腔，打断了远近端骨的连接通路，感染性骨不连需采取感染病灶清除，植骨或行骨延长等方法治疗。萎缩性骨不连表现为周围瘢痕组织替代骨痂，骨折端血供或骨活性较差，有时表现为骨吸收[7，8]。骨不连有时不是单纯的一种因素导致的，可能同时合并有好几种。所以针对骨不连，在改善稳定和血供的基础上，改善成骨活性和增加骨愈合的能力会极大的改善骨不连的治愈成功率[9]。

骨不连的传统治疗方法为开放固定+有效的植骨，此有效的植骨多选择自体骨，自体骨有良好的支撑性及骨诱导性，同时有骨髓细胞，因而成骨效果好，是良好的植骨材料，但因自体骨数量有限，增加创伤，增加手术时间及并发症风险，尤其不适用儿童及年老体弱者[10]。传统的开放手术切口大，失血多，增加感染风险，延长了住院时间及住院费用。随着分子生物学及组织工程学的发展，有没有一种更有效、更微创、更节约的一种治疗骨不连的方法呢？组织工程化间充质干细胞、PRP的研究给我们带来了希望。国内外文献表明，临床在治疗骨不连方面取得了不错的效果[11]，但都仅限于一种方法治疗骨不连。我们将两种方法联用，取得了不错的疗效。从理论上分析，外周血干细胞和骨髓干细胞来源于中胚层，具有多项分化的潜能，在特定的理化条件与细胞因子诱导下，可定向的向成骨细胞方向转化[12]。PRP是在血小板裂解同时释放大量细胞因子，细胞因子可诱导干细胞向成骨细胞转化[13]和促进组织血管化，所以干细胞有效的解决了成骨种子细胞的问题，PRP促进了骨诱导及加速成骨问题，同时PRP裂解产生的细胞因子可促使白细胞向局部转移，加强了局部的抗感染性，有效的防止伤口感染[14]。

干细胞或PRP治疗都存在不能有效固化在治疗部位和活性成分流失的问题，在本研究中，我们加入凝血酶从而使血浆中的纤维蛋白原形成纤维蛋白凝胶，形成自体组织工程支架材料使干细胞和细胞因子固化在骨折断端，避免了流失，为干细胞成骨提供一定的支撑，促使其向成骨细胞转化的过程，同时凝血酶还可迅速裂解血小板，使血小板中的细胞因子大量释放，进一步促进修复效应。

虽然组织工程化干细胞及PRP在治疗骨不连方面有巨大的潜力，但还有一些问题需要进一步研究[15]。①本研究中的干细胞为体内动员，而更大量的间质干细胞获取有待于体外扩增和培养，对技术要求较高，且目前仅限于临床研究阶段，但贵州医科大学附属医院已是首批国家卫计委和药监局批准的干细胞临床研究机构，后续研究正在申请备案并开展；②组织工程化干细胞诱导、与可吸收生物材料的符合构建还需进一步的研究；③PRP释放的细胞因子数量，种类巨多，在细胞因子分类及作用机理研究方面还有待深入研究。

总之，造成骨不连的因素不只是单纯的一种因素，在治疗骨不连时，有效的固定，良好的血运，作为种子细胞向成骨细胞转化的干细胞，加速干细胞向成骨细胞转化的PRP都是治疗骨不连的确切有效的方法。只有在满足这些条件的情况下，才会大大提高骨不连的治疗效果。

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收稿日期：2018-3-20；修回日期：2018-3-30

编辑/成森