白英提取物抑瘤有效成分的初步筛选

王卫芳，刘 悦，吴广谋，杨 唐，张 迪，徐雅娟*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省中医药科学院，长春 130012；

3.军事医学研究院军事兽医研究所，长春 130122）

白英（Solanum lyratum Thunb.），是一种常用抗癌中草药[1]，为茄科多年生草质藤本植物，别名白毛藤、蜀羊泉等[2]。近年来，国内外学者对白英的药理活性做了大量的研究，其热点主要集中于抗肺癌[3]、肝癌[4-5]、抗炎[6]、抗过敏[7-8]、保肝[9]、增强免疫作用[10]等方面。并对成分进行了分析[11-16]，目前对不同的白英提取物的作用机制有了初步的了解[17-20]，但仍需进一步明确。本研究初步筛选白英水提液的不同部位对人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞BGC -823细胞是否具有抑制增殖活性及诱导凋亡作用，从而确定白英水提液抗肿瘤作用有效部位，为进一步探讨其分子水平机制及抗癌新药的开发，奠定一定的理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基（HyClone公司）、胎牛血清（Gibco公司）、Cell Counting Kit-8 试剂盒（MCE公司）。

1.2 细胞株培养 细胞培养于含10%胎牛血清、1%抗菌药物（青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L）的DMEM高糖培养基中，放置于37 ℃、含5% CO2、饱和湿度条件的细胞培养箱中常规培养。细胞呈单层贴壁生长，依细胞生长情况换液，待细胞长至铺满瓶底，以0.25%胰酶消化传代。

1.3 实验分组 空白对照组（加入等量的完全培养基）；实验组按白英提取物的浓度分为5个剂量组；阴性对照组为含细胞的DMEM培养液；阳性对照组为DMEM培养液倍比稀释的5-Fu注射液。

1.4 CCK-8法测定细胞增殖抑制率 每种药物浓度设6个平行孔，培养48 h，加入10 μL CCK-8培养1h后，酶标仪测定450 nm各孔的OD值，以培养液调零。按公式计算细胞生长抑制率（IR，inhibition rate）。

抑制率IR = [（Ac-As）/（Ac-Ab）] × 100% 。其中，As：实验孔吸光度 （含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液）； Ac：对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物）； Ab：空白孔吸光度（含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物）。

1.5 形态学观察 将人宫颈癌HeLa细胞铺于六孔板内，细胞贴壁后，加入不同浓度的白英药物作用24 h，吸弃培养基，PBS冲洗2次，每孔加入1 mL培养基，于倒置显微镜下观察细胞数量和形态并拍照。

1.6 HE（苏木精/伊红）染色 胰酶消化贴壁生长的HeLa细胞，调整细胞浓度为1 ×105个/mL，滴加到置于24孔板底部的盖玻片上，制作细胞爬片，24 h后加入不同浓度白英药物，继续培养24 h取出爬片，PBS清洗2次，95%乙醇固定15 min，PBS清洗3次，每次1 min。苏木素染色10 min，蒸馏水冲洗1 min。1%盐酸酒精分化1 min，蒸馏水冲洗1 min，1%稀氨水返蓝5 min，蒸馏水冲洗1 min，浸入0.5%伊红中5 min，蒸馏水冲洗1 min，分别浸入80%、90%、95%乙醇1 min，共2次，无水乙醇1 min共2次，自来水清洗l min。伊红染色1 min，自来水清洗30 s。普通光学显微镜下观察。

1.7 AO/EB（吖啶橙/溴化乙啶）染色 取对数生长期的细胞，以0.25%胰酶消化，收集细胞，计数，接种在24孔板中。细胞贴壁后，将细胞培养液换为含不同浓度白英药物的新鲜培养基，继续常规培养。培养24 h后，弃去培养基，PBS清洗去除残余培养基和未贴壁细胞，加入新的PBS。按照每毫升PBS中加入20 μL工作液（100 μg/mL AO溶液和100 μg/mL EB溶液按1：1混合）。室温放置2～5 min后于荧光显微镜下观察。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（x± s ）表示，组间比较采用单因素ANOVA方差分析，组间两两比较采用SNK-q法检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白英提取物体外对HeLa细胞、BGC-823细胞的增殖抑制作用 实验结果显示，白英提取物5个浓度对人宫颈癌HeLa细胞和胃癌BGC-823细胞作用72 h后，有明显的抑制作用。统计学分析表明，不同浓度的药物对细胞抑制率存在差异，但药物浓度超过0.135 3 mg/mL时，大部分细胞都产生形变，贴壁能力下降，呈漂浮现象，抑制率反而下降。浓度为0.067 6 mg/mL时，对2种细胞的抑制率达到最大，分别为86.21%和88.91%。白英提取物干预后，对相同的细胞，与0.541 mg/mL浓度组比较，5个浓度组之间比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与5-Fu组相比，差异无统计学意 义（P＞0.05）；与BGC-823细胞组的抑制作用相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 白英提取物体外对HeLa细胞、BGC-823细胞的增殖抑制作用（x± s ）

2.2 HE染色 HE染色观察不同浓度白英提取物作用Hela细胞48 h后细胞凋亡情况。随着药物浓度增加，实验组可见凋亡细胞逐渐增多，高浓度组细胞呈碎块状致密浓染，中低浓度组可见部分细胞变圆，边界较清晰，细胞浆被伊红染成深浅不同的淡红色。

2.3 AO/EB染色检测白英提取物对细胞的作用 AO是DNA染料，能进入细胞膜正常的细胞中，与DNA结合发出绿色荧光；EB膜不通透性染料，可使坏死的细胞或者凋亡后期继发性坏死细胞呈橙红色。

未经药物作用的阴性对照细胞被AO染成绿色，高浓度（5 mg/mL）药物作用后细胞形态发生明显的变化，形态由正常的梭形变成了椭圆形或圆形，细胞核被染成桔红色，膜出现泡状突起，凋亡细胞比例逐渐增多，细胞核碎裂，呈现出凋亡性死亡，同时出现一些被染成致密橙红色的坏死细胞；中浓度药物（2.5 mg/mL）作用后，一些细胞的胞质被染成黄绿色，一些细胞的细胞核碎裂，胞浆浓缩，聚集于一边，呈块状或新月状；低浓度药物作用时，少量细胞出现凋亡现象。

3 讨论

肿瘤是目前严重威胁人类健康的主要疾病之一。寻找有效的抗癌药物与方法，使人们的生活远离癌症，是引起世界医学界重视的一个重要的研究课题。传统的治疗方法在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞有一定的影响，治疗中出现明显的不良反应，因此天然药物、靶向药物、传统中药的作用效果和作用机制越来越受到人们的关注和应用。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（PCD），多种因素可以诱导细胞凋亡，可以影响癌细胞的生长和繁殖。目前发现多种传统中药能有效的对抗癌症的进展，但是中药治疗肿瘤、引起细胞凋亡的机制还不是非常明确。细胞凋亡途径一般可以分为死亡受体通路、线粒体途径和内质网应激途径。影响细胞凋亡的基因有细胞凋亡过程中的表达基因、促凋亡基因和抑胞凋亡基因。其异常与多种疾病密切相关，如肿瘤、免疫疾病等。Bcl-2家族是迄今为止被研究较多的细胞凋亡基因之一。其中包括Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白及Bax和Bak等促细胞凋亡蛋白。一些传统中药被报道通过影响Bax/Bcl-2比例的变化来调控细胞凋亡。以及caspase、Fas等蛋白、线粒体膜电位变化、NF-κB 途径等都会影响细胞凋亡[21-22]。因此，细胞凋亡的发生及调控机制非常复杂，需要我们进一步去深入研究。

综上所述，白英提取物能诱导HeLa、BGC-823细胞的凋亡，有效部位的抑瘤率不同。然而，白英提取物的有效部位活性成分及其抗癌机制还有待进一步的实验研究。