HPLC法测定饲料中癸氧喹酯含量

宋亚伟 吴昊 刘发全 李东风 丁在亮 张莉 蔡东东

摘 要：建立了饲料中癸氧喹酯含量测定的高效液相色谱法。采用三氯甲烷-甲醇溶液提取饲料中癸氧喹酯，用Waters的HLB小柱进行纯化，色谱柱为Waters公司Symmetry C18 （ 4.6 ×250mm ，5μm）；流動相为0.025mol/L氯化钙溶液+甲醇（15∶85，V/V）；检测波长265nm；流速为1.0mL/min；进样量为20μL。外标法定量。该方法在1-20μg/mL浓度范围内，线性方程y=115.128216x+10.785087，呈现良好的线性关系（R2=0.99991），最低检测浓度为1.0mg/kg。回收率均在85-100%之间。可用于饲料中癸氧喹酯的含量测定，该方法准确性强，重复性好，操作简单。

关键词：饲料 癸氧喹酯 含量 高效液相色谱法

Determination of Deoxyquinate in Feed by High Performance Liquid Chromatography Song Yawei，Wu Hao，Liu Faquan，Li Dongfeng，Ding Zailiang Abstract：The high performance liquid chromatography method was established to determine the content of deoxyquinate in feed. The samples were purified with HLB column（Waters Symmetry C18 4.6 ×250mm 5μm），using 0.025mol/L Calcium chloride solution and methanol（15：85，V/V） as mobile phases with flow rate 1.0mL/min ，detected by 265nm，taked 20μl ，detected by Diode array ultraviolet detector（DAD）. External standard method was used for quantification.The results showed that there was a good separation of deoxyquinate at 1-20μg/mL. The linear ranges were as follows：（ y=115.128216x+10.785087，R2=0.9991）.The detection limit was 1.0mg/kg . The recovery rate was 85-100%.Therefore， the method can be used for the determination of decoquinol in feed， which had high precision， high repeatability and easy Operation.

Key words：Feed；Deoxyquinate；Content；HPLC

癸氧喹酯（Decoquinate）是一种喹啉类抗球虫药，不但对球虫的子孢子和滋养体有强烈的抑制作用，而且对发育中的第一代裂殖体有杀灭作用，对卵囊的孢子化过程亦有抑制作用[1]。《中华人民共和国兽药典》中规定，癸氧喹酯在肉鸡中休药期为5天（中国兽药典委员会，2015）。但是在饲料产品安全监管工作中发现超限量添加，不遵守休药期规定，违反配伍禁忌等违规现象，因此亟待加强饲料中癸氧喹酯含量测定的研究。本文建立了高效液相色谱法测定饲料中癸氧喹酯含量，方法简单快捷，定量范围广，可行性高，重现性号，灵敏度高，能够满足饲料质量安全检测的要求。

1材料与方法

1.1 仪器及试剂

1.1.1 主要仪器设备

高效液相色谱仪（Agilent公司HP1100，配有二极管阵列紫外检测器）；色谱柱（Waters公司Symmetry C18，4.6×250mm，5μm） ）；十万分之一天平（德国赛多利斯BS21S，感量0.01mg，）；万分之一天平（德国赛多利斯Bs224s，感量0.1mg）；离心机（日立CR22G）；超声波清洗机；超纯水器；螺口自动进样瓶；数字可调瓶口分配器；单通道可调移液器；0.45?m微孔滤膜。

1.1.2 主要试剂

癸氧喹酯对照品（批号K0651211，含量99.7% 中国兽药监察所）；甲醇（色谱纯，4L/瓶，美国FISHER Chemical公司）；氯化钙（分析纯，上海试剂公司）；超纯水（水质达18.25MΩ·cm，符合国家实验室用水规格（GB6682-92））。

1.1.3 实验饲料

本实验选取的饲料由安徽新华饲料科技有限公司提供。

1.2 HPLC的色谱条件

二极管阵列紫外检测器（DAD），检测波长265nm；流速1.0ml/min；流动相为氯化钙甲醇溶液+甲醇（15∶85，V/V）；Symmetry C18色谱柱（4.6×250mm 5μm）；自动进样器，进样量为20?l。

1.3实验方法

1.3.1 试液配制

提取液：氯化钙甲醇溶液（称取氯化钙10g，加甲醇1000ml，超声溶解[2] ）；

流动相：氯化钙甲醇溶液+甲醇（15∶85，V/V）；

储备液与工作液：精确称取20mg癸氧喹酯标准品（精确至0.00002 g）于200 mL容量瓶中，用氯化钙甲醇溶液超声溶解，冷却，移取适量癸氧喹酯储备溶液，用流动相稀释成浓度分别为20、10、5.0、2.0、1.0μg/mL的标准工作溶液，现用现配。

1.3.2试样制备

按GB/T14699.1的规定选取有代表性样品200-500g，用四分法缩至100g，粉碎通过0.45mm孔徑筛，充分混匀，贮于磨口瓶中备用。

准确称取5.0g配合饲料（浓缩饲料3.0g，预混合饲料1.0g）试样，置于具塞锥形瓶中，精确加入氯化钙甲醇溶液50ml，栓塞置于超声波仪超声提取30min。将试样提取液倒入离心管中，3000r/min离心15min。取离心上清液用0.45?m滤膜过滤，滤液作为试样溶液，上机待用。

1.3.3样品定性

将样品峰的保留时间与癸氧喹酯对照品出峰的保留时间相比较，从而对样品中癸氧喹酯进行定性。

1.3.4样品定量

采用外标法，数据处理系统可自动计算峰面积或根据具体峰型进行手动积分，将每个待测样品的峰面积的平均值代入标准曲线，即可算出各自的浓度。

2 结果

2.1线性响应

将浓度分别为20、10、5.0、2.0、1.0μg/mL的癸氧喹酯标准工作溶液，供高效液相色谱分析，以各色谱峰峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

从图1和图2可以看出，在1-20μg/mL浓度范围内，呈现良好的线性关系，可以用于准确定量。

2.2 灵敏度

将标样溶液经过逐级稀释后进样分析，最终得出该方法测定癸氧喹酯的最低检测浓度为1.0mg/kg。

2.3 方法准确度和精密度

采用空白样品添加法，对配合饲料分别添加浓度为10、20、30mg/kg进行复核实验；对浓缩饲料添加浓度为20、40、80mg/kg进行复核实验；对预混合饲料添加浓度为100、200、300mg/kg进行复核实验。每种浓度5个样品，重复3批次，求回收率、批内、批间变异系数。测定结果见表1至表3：

从上述表中数据可以看出，平均回收率均在85%以上，变异系数均小于5%，无论是各种浓度的回收率还是变异系数均满足试验要求，结果表明该方法稳定性好、重复性好，适用于饲料中癸氧喹酯的测定。

3 结论

通过对前处理条件和液相色谱条件的优化，建立了高效液相色谱法测定饲料中癸氧喹酯含量。该方法提取过程简单，操作步骤较少、灵敏度高，稳定性、重现性好，能够满足饲料质量安全检测的要求，加之，高效液相色谱法已成为应用非常广泛的一种理化检测手段，因此该方法能广泛用于饲料中药物成分的检测。

参考文献

[1] 周玉武，栾明娜，徐福亮，邵耀东.高效液相色谱法测定癸氧喹酯溶液的含量[J].中国兽药杂志，2009，43（02）：32-34.

[2] 陈启友，隆雪明，匡光伟，李艳平.高效液相色谱法测定饲料中癸氧喹酯的含量[J].中国饲料，2014（13）：37-38+42.

[3] WilliamsRB.The Mode of Action of Anticoccidial Quinolones （6-decyloxy-4 -hydroxyquinolone-3 -carboxylates） in Chickens[J] .IntJParasitol， 1997， 27：101 -111.

[4] WilliamsRB.TracingtheEmergenceofDrug-resistance in Coccidia（Eimeriaspp.） of Commercial Broiler Flocks Medicated with Decoquinate for the First Time in the United Kingdom[J] .VetParasitol， 2006， 135：1-14.

[5] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S] .二 O一五年版（一部）：附录 43.

[6] SemanDH， HayekM G.HPLCAnalysis of Decoquinatein Feeds[J] .VetHumToxicol， 1986 ， 28（4）：325-327.

作者简介：宋亚伟 男 1987年6月 职称无 从事饲料质量安全检测。