升麻葛根汤抗炎镇痛及体外抑菌作用的研究

秦汝兰，王丹萍，吕重宁

升麻葛根汤为解表剂，源于《阎氏小儿方论》，又名平血饮，其药材包括升麻6g，葛根9g，白芍6g，甘草6g［1-2］，该方具有辛凉解肌，透疹解毒之功.主治麻疹初起，疹发不出，身热头痛，咳嗽等症状［3-4］.方中君药升麻的主要化学成分为苯丙素类化合物.经研究发现［5-6］，苯丙素类化合物以其显著的抗菌、抗炎、镇痛及抗氧化活性，逐渐成为研究的热点.方剂的臣药—葛根，其主要化学成分葛根素及其衍生物具有较强的抗炎、抗痛风作用［7-8］.本研究采用小鼠耳肿胀法、扭体法及热板法三种模型，探讨升麻葛根汤水提液的抗炎、镇痛作用，并通过K-B纸片扩散法研究升麻葛根汤体外抑菌活性，为其药理作用研究和临床开发应用提供一定的参考依据.

1 材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

升麻、葛根、白芍、甘草等药材均购于通化医药大厦，经通化师范学院于俊林教授鉴定为升麻（Cimicifuga foetidaL.g）、葛根（Pueraria lobata（Willd.）Ohwig）、甘草（Glycyrrhiza.uralensisFischg）以及白芍（Paeonia lactiflorapallg）正品；阿司匹林肠溶片（石家庄康力药业；批号：150203）；二甲苯（天津市恒兴化学试剂；批号：20170325）；冰醋酸（天津富宇精细化工；批号：20161111）；MH琼脂培养基（江门市凯琳贸易）；营养肉汤（广东环凯生物科技）；药敏纸片（OXOID，广州纳特生物科技）；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylo⁃coccus aureus）；革兰氏阴性菌：大肠埃希菌（pseudomonas aeruginosa），两种菌株来源于医药学院微生物实验室.

1.2 实验动物

KM小鼠，雄性，体重20±2g，由长春高新医学动物实验研究中心提供（动物合格证号：SCXK（吉）2003-0004）.环境温度23±2℃，相对湿度为50%～60%，饲养期间自由摄食饮水.

1.3 实验仪器

耳肿打耳器（直径6mm，北京创博生物科技）；BS124S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统）；YLS-6B型热板仪（济南益延科技）；YXQLS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业医疗设备厂）；SPX生化培养箱（上海博讯实业医疗设备厂）；净化工作台（上海新苗医疗器械）等.

2 实验方法

2.1 升麻葛根汤的制备

按照升麻葛根汤复方3倍用药量，分别称取升麻6g、葛根9g、白芍6g、甘草6g，加入适量蒸馏水，浸泡过夜，回流提取2次，合并滤液，减压浓缩，浓缩液定容至50mL，于-4℃冰箱中保存备用，临用前稀释成所需浓度［9］.

2.2 实验动物

雄性KM小鼠，体重20±2g，随机分成5组，分别为空白对照组（生理盐水）、阳性对照组（500mg·kg-1阿司匹林）、升麻葛根汤高（347.1mg·kg-1）、中（231.4mg·kg-1）、低（115.7mg·kg-1）剂量组，每组10只.经口给药14天，于末次给药1h后，向各组小鼠右耳前后两面分别均匀涂抹0.05mL二甲苯致炎，左耳涂以相同体积的蒸馏水作为对照，致炎30min后处死小鼠，沿耳廓基线将双耳剪下，然后用直径6mm的打孔器分别在左右耳相同的位置打下圆形耳片，立即称定，按公式计算小鼠耳部致炎后耳肿胀抑制率［10-11］.

耳肿胀抑制率（%）=（空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/空白对照组肿胀度×100%

2.3 小鼠热板法实验

将热板仪温度控制在55±0.5℃并将小鼠置于其上进行观察.小鼠第一次舔后足时间即为痛阈值，选取痛阈值在5～30s范围内的雄性KM小鼠50只，随机分成5组，给药方法同“2.2”项下方法.末次给药前，测定每只小鼠痛阈值，实验共操作2次，每次实验操作间隔10min，计算小鼠给药前平均痛阈值.分别测定各组小鼠于末次给药后30min、60min、90min、120min时的痛阈值.若小鼠60s内无反应，应立即取出小鼠，避免小鼠足部烫伤，其痛阈值按60s计［12-13］.

2.4 冰醋酸致小鼠扭体反应模型镇痛实验

选取雄性KM小鼠，体重20±2g，随机分为5组，每组10只，分组及给药同“2.2”项下方法.末次给药前12h禁食，不禁水，末次给药1h后，以0.1mL/10g体重的给药量，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液致炎，立即记录各组小鼠15min内扭体次数，根据公式计算抑制率［14-15］.

疼痛抑制率（%）=（空白对照组扭体次数-给药组扭体次数）/空白对照组扭体次数×100%

2.5 K-B纸片扩散法体外抑菌试验

（1）菌悬液及含菌平板的制备.取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌两种试验标准菌种，分别制成1011～1012cfu/L的均匀菌悬液.将融化后的灭菌培养基倾入无菌培养皿中，待凝固后加入0.1mL菌悬液，用无菌涂布环涂布均匀，于37℃恒温培养箱中培养24h，备用［16］.

（2）升麻葛根汤水提液抑菌作用及抑菌率考察.取直径为6mm左右的药敏纸片和阴性对照纸片均匀间隔贴于“2.5（1）”项下含菌平板表面，37℃恒温培养18～24h后取出，用游标卡尺测定各药敏纸片抑菌圈直径，平行操作3次，计算抑菌圈直径的平均值.按下述标准判断升麻葛根汤水提液抑菌作用：抑菌圈直径d＝6mm为不敏感，6mm＜d＜10mm为低度敏感，10mm≤d＜15mm为中度敏感，15mm≤d＜20mm为高度敏感，d≥20mm为极敏感.敏感度越高表示抑菌效果越好［17］.

抑菌率（%）=（试验组抑菌圈平均直径-空白滤纸片直径）/空白滤纸片直径×100%

（3）升麻葛根汤水提液最小抑菌浓度（MIC）测定.采用二倍稀释法将升麻葛根汤水提液配制成浓度为 400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL的稀释液，用无菌镊子将浸于不同浓度稀释液后的药敏纸片和阴性对照纸片均匀间隔贴于“2.5（1）”项下含菌平板表面，37℃下恒温培养18～24h后取出，观察菌体生长情况，生长菌体为阳性（+），不生长菌体为阴性（-），以不生长菌体的最低稀释浓度为升麻葛根汤水提液的最低抑菌浓度［18］.

2.6 统计学处理

3 结果与分析

3.1 升麻葛根汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

小鼠耳肿胀实验中，二甲苯可导致小鼠耳部血管扩张、血管通透性增强，从而引起小鼠耳部肿胀.由表1实验结果可知，二甲苯致各组小鼠耳部肿胀效果显著.与空白对照组比较，阿司匹林对照组对于小鼠的耳肿，具有较强的缓解作用（P＜0.01），抑制率为29.12%.升麻葛根汤高、中剂量组同样表现出一定的抑制作用（P＜0.01；P＜0.05），抑制率分别为24.45%和18.93%，由实验结果可判断，升麻葛根汤对二甲苯致小鼠耳廓急性炎性肿胀具有一定的抑制作用.

表1 二甲苯致耳肿胀模型抗炎实验（±s，n=10）

表1 二甲苯致耳肿胀模型抗炎实验（±s，n=10）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组抑制率(%)—29.12 24.45 18.93 10.87剂量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7肿胀度（mg）11.78±1.47 8.35±0.93**8.90±1.75**9.55±0.95*10.50±0.84

3.2 升麻葛根汤对热板法刺激疼痛的镇痛作用

热板法实验结果如表2所示，三组给药剂量组均使小鼠的痛阈值有所延长，且呈剂量依赖性.给药前空白对照组及各剂量组小鼠痛阈值无显著性差异；与空白对照组比较，给药后30min、60min、90min、120min后，升麻葛根汤高、中剂量组均能明显延长热板所致小鼠的痛阈值（P＜0.05；P＜0.01）.给药60min后，升麻葛根汤低剂量组也能够明显延长热板所致小鼠的痛阈值（P＜0.05），上述实验结果表明，升麻葛根汤各给药剂量组小鼠对热板刺激疼痛实验模型的刺激敏感，实验结果进一步提示升麻葛根汤具有镇痛作用.

3.3 升麻葛根汤对冰醋酸致小鼠扭体的影响

由表3可知，与空白对照组相比，阿司匹林对照组和升麻葛根汤高剂量组均能够明显降低冰醋酸致小鼠扭体反应的次数（P＜0.01；P＜0.05），抑制率分别为37%和23%，提示升麻葛根汤对冰醋酸所致小鼠的疼痛性反应具有对抗作用.

表2 升麻葛根汤对小鼠热板疼痛反应的影响（±s，n=10）

表2 升麻葛根汤对小鼠热板疼痛反应的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组120min 14.92±3.13 25.24±4.70**22.13±3.73*21.28±2.88*19.00±4.08剂量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7给药前15.87±2.48 18.28±2.42 17.43±3.03 17.78±1.21 17.41±2.25 30min 14.95±3.52 25.40±4.87**22.95±3.98*21.71±3.06*19.11±5.01 60min 16.57±2.18 25.27±4.01**24.32±2.65**21.71±2.91*21.10±2.84*90min 15.02±2.05 23.45±4.28**20.43±2.34*19.62±2.79*17.19±3.00

表3 冰醋酸致小鼠扭体反应模型镇痛实验（±s，n=10）

表3 冰醋酸致小鼠扭体反应模型镇痛实验（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组扭体次数25.00±4.08 15.75±4.35**19.25±3.20*20.75±2.06 22.25±2.22剂量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7抑制率（%）—37 23 17 11

3.4 升麻葛根汤对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用

由表4可得出，升麻葛根汤对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有不同程度的抑制作用，抑菌率分别为87.17%、57.17%，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌.

表4 升麻葛根汤水提液抑菌作用及抑菌率（±s，n=3）

表4 升麻葛根汤水提液抑菌作用及抑菌率（±s，n=3）

试验菌种金黄色葡萄球菌大肠杆菌抑菌圈平均直径（mm）11.23±0.25 9.43±0.40抑菌率(%)87.17 57.17

3.5 升麻葛根汤对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌浓度的影响

通过表5可以看出，升麻葛根汤水提液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更明显，当升麻葛根汤浓度低于12.5mg·mL-1时，金黄色葡萄球菌出现明显的生长；当升麻葛根汤浓度低于50mg·mL-1浓度时，大肠杆菌显示出明显的生长.由此得出，升麻葛根汤对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为12.5mg·mL-1、50mg·mL-1.

表5 升麻葛根汤水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）

4 讨论

二甲苯所致小鼠耳肿胀的急性炎症反应，可能涉及炎症介质的释放，如5-羟色胺或缓激肽等.本研究选用二甲苯致炎模型研究升麻葛根汤的抗炎作用，实验结果显示，升麻葛根汤高剂量组能显著减轻小鼠耳肿胀程度，抑制率为24.45%，分析其原因可能为升麻葛根汤能够抑制5-羟色胺或缓激肽等炎症介质的释放，从而使小鼠耳肿胀程度有所缓解.小鼠热板法实验的原理是通过一定强度的温度来刺激小鼠足部产生疼痛反应，并以热刺激开始至舔足部的反应时间为依据评价药物的镇痛作用，是一种反射性测痛模型［19］.本实验通过热板法研究升麻葛根汤的镇痛作用，由实验结果可知，升麻葛根汤高、中、低剂量组在不同测试时间点能明显延长小鼠舔后足的时间，表明升麻葛根汤具有一定的镇痛作用.曹丽等［20］对升麻不同品种炮制前后的抗炎镇痛药理作用研究发现，升麻各样品对小鼠热刺激的痛阈值均有所增加.本研究还采用了另外一种经典致痛模型即冰醋酸致小鼠扭体反应，该反应是通过醋酸刺激腹膜引起炎性疼痛来观察小鼠表现的扭体反应，此实验模型为筛选非甾体抗炎镇痛作用的一种敏感实验方法［21］.实验结果表明，升麻葛根汤高浓度剂量组能显著减少醋酸所致小鼠的扭体反应次数，抑制率为23%.以上各实验结果表明，升麻葛根汤具有良好的抗炎镇痛效果.

纸片扩散法常用于考察药物的抑菌活性，具有简单、易操作等优点.纸片扩散法实验中，药物在扩散的同时纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，通过纸片周围形成的透明抑菌圈的直径大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，且抑菌圈直径的大小与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小，药物的抑菌作用越强［22］.在体外抑菌实验中，发现升麻葛根汤水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的体外抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌抑菌效果优于大肠杆菌，抑菌率分别为87.17%、57.17%.最低抑菌浓度实验与抑菌作用实验结论一致，升麻葛根汤水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌最低浓度分别为12.5mg·mL-1、50mg·mL-1.

5 结论

本实验采用小鼠耳肿胀法、扭体法及热板法三种抗炎镇痛模型以及K-B纸片扩散法，研究升麻葛根汤水提液的抗炎、镇痛作用和抑菌活性，实验结果显示，升麻葛根汤具有良好的抗炎镇痛作用及体外抑菌活性，其抗炎作用机制可能与升麻葛根汤抑制5-羟色胺或缓激肽等炎症介质的释放有关，但具体作用机制有待后续更深入地研究，本实验结果为升麻葛根汤制剂的临床开发应用提供一定的参考依据.