外源cGMP调控盐胁迫下黑麦草种子萌发机制

宿梅飞,魏小红,辛夏青,岳 凯,赵 颖,韩 厅,马文静,骆巧娟

甘肃农业大学生命科学技术学院,兰州 730070

环鸟甘酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)是一种具有细胞内信息传递作用的第二信使(second messenger),可被G蛋白偶联受体(G-protein linked receptor)激活的蛋白激酶(protein kinases)所活化[1],进而将胞外信号转至细胞核,是一种具有广泛生物学活性的环核苷酸。cGMP在生物、非生物胁迫及激素响应等众多的植物生理过程中起着非常重要的调节作用[2],其信号通路以及它的反馈调节是通过cGMP合成和降解的相互作用来控制,其合成和降解分别是由鸟苷酸环化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)完成的[3]。GC能催化GTP形成cGMP,使其发挥生物学功能,而PDE能使cGMP变成5′GMP而失活。因此,植物能准确调控体内的cGMP含量,进而参与各种生理过程[4]。目前关于cGMP在植物信号转导中的作用正在逐渐被揭示[2]。研究发现,在一些植物材料中每克新鲜样品中含有1—10 pmolcGMP[5]。通过施加外源cGMP的膜透性类似物8-Br-cGMP能增强拟南芥(Arabidopsisthaliana)对盐胁迫的耐受性[6]。此外,还发现在辣椒(Capsicumannuum)中,cGMP可以调节Na+和K+的流量来维持离子平衡[7]。当植物受到非生物胁迫,例如渗透胁迫或盐胁迫时植物中的cGMP含量会上升5—10倍[8]。说明cGMP能增强植物对胁迫的耐受性,并作为一种信号物质在植物的胁迫响应中发挥着重要调控作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年5月—9月在生命科学技术学院植物生理实验室进行,供试材料为多年生黑麦草种子,购于甘肃农业科学院种子公司,千粒重为2.0034 g,室温避光保存、8-Br-cGMP购买于ApexBio公司。

1.2 试验方法

选取籽粒饱满,大小一致,无病虫害黑麦草种子,用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒5 min,再用蒸馏水冲洗5—6次。将消毒后的黑麦草种子随机播在铺有两层滤纸的培养皿(φ=9 cm),每皿放置50粒,用不同浓度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)的NaCl培养液和含有20 μmol/LcGMP的不同浓度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)的NaCl溶液培养。所有的培养皿放入在(25±1)℃、相对湿度为80%、12 h光照/12 h黑暗的条件下的恒温光照培养箱中培养,光照强度4000 Lux,每24 h更换一次处理液4 mL。以胚根露出作为种子萌发的标志,每24 h记录一次,一直测定至第7天,测定其发芽指标,每组处理设置了3个重复。

另外试验设计了3个处理：(1)CK(蒸馏水);(2)100 mmol/L NaCl溶液:(3)20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl 。分别用蒸馏水、100 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl浸泡黑麦草种子48 h,将种子置于垫有双层滤纸的培养皿(φ=9 cm)中,每皿50粒种子,每个处理重复3次,每个培养皿加处理液4 mL,24 h更换一次处理液。培养在(25 ± 1)℃,12 h光照/12 h黑暗条件下,分别在处理后的0、2、4、6 d取样,用于萌发期主要物质的测定；再取2、4、6、8 d测定其幼苗的生理指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 种子发芽指标

发芽率(germination percentage,GP)=7 d内发育种子数/测试种子数×100%[17]

发芽势(germination energy,GE)=前4 d发芽种子数/测试种子总数×100%[18]

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)[19](式中,Dt为发芽日数,Gt为与Dt相应的每天的发芽种子数)

活力指数(VI)=GI×第7天正常幼苗平均鲜重[20]。(式中,幼苗鲜重为称取5株幼苗的重量)

植株全长、根长、叶长用游标卡尺测量(长度为总共50株植株的平均值)。

1.3.2 生理指标的测定

1.4 数据统计分析

每组数据设定3个重复,采用Microsoft Excel 2010整理分析数据,使用SPSS19.0 (Duncan法)进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 外源cGMP对不同浓度盐胁迫下黑麦草种子萌发的影响

由表1知：与CK相比,随着NaCl浓度的升高,黑麦草的发芽率(G)呈现先升高后降低的变化趋势,不同处理差异显著(P<0.05)；发芽势(GE)、发芽指数(GI)和活力指数(VI)均呈现逐渐降低的变化趋势,不同处理差异显著(P<0.05)。其中,50 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子比对照组芽率提高了3.5%；而100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子的发芽率(G)、发芽势(GE)、发芽指数(GI)和活力指数(VI)分别比对照降低了38.9%、73.5%、141.8%和141.0%；而当NaCl的浓度达到250 mmol/L时,黑麦草种子的发芽率(GP)、发芽势(GE)、发芽指数(GI)和活力指数(VI)均达到最低,黑麦草种子基本丧失活性。在不同浓度(50、100、150、200、250 mmol/L)NaCl胁迫下,加入20 μmol/LcGMP皆能提高黑麦草种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。其中对100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子萌发最为显著。20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子比单独100 mmol/L NaCl处理的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别提高了7.4%、133.3%、52.1%和104.2%。

2.2 外源cGMP对盐胁迫下黑麦草种子萌发生长状况的影响

由图1可知：从植物的生长形态上明显看出,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子在萌发过程中,比单独100 mmol/L NaCl胁迫的黑麦草种子萌发时有明显的促进生长的作用。由表2可以得到：20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl 处理的比单独100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子的全长、根长及叶长都有显著的提高,分别提高了2.5、2.8倍和2.6倍。

2.3 外源cGMP对盐胁迫下种子萌发过程中主要物质变化的影响

在不同的处理条件下,随着处理时间的延长,黑麦草种子内可溶性蛋白含量均呈现逐渐上升的趋势(图2)。在处理的第2天,100 mmol/L NaCl和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子内可溶性蛋白含量显著高于对照组,且20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子内可溶性蛋白比100 mmol/L NaCl处理下的可溶性蛋白含量升高15.7%,比对照提高了56.1%；在处理的第4天,三组处理可溶性蛋白含量变化不明显；在处理的第6天,各处理之间差异显著(P<0.05),其中加入第二信使cGMP处理的黑麦草种子内可溶性蛋白含量比对照增加了21.3%,比单独100 mmol/L NaCl胁迫下升高了8.4%。

表1 不同浓度NaCl对黑麦草种子萌发的影响

同列数值不同小写字母表示差异达5%显著水平

表2 外源cGMP对100 mmol/L NaCl胁迫下黑麦草种子生长状况的影响

图1 外源cGMP对100 mmol/L NaCl胁迫下黑麦草种子生长状况的影响Fig.1 Effects of exogenous cGMP on seed germination of growth condition under 100 mmol/L NaCl stress

在不同的处理条件下,黑麦草种子内可溶性糖含量均随着处理时间的延长整体呈现升高的趋势(图2)。在处理的第2天对照组可溶性糖含量比第0天提高了59.1%,而加入外源cGMP和单独NaCl胁迫下可溶性糖含量变化不明显；在处理的第4天,100 mmol/L NaCl和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子内可溶性糖含量达到最大值,其中加入外源cGMP处理的比100 mmol/L NaCl单独处理和对照分别增加了10.7%和33.3%；在处理的第6天,100 mmol/L NaCl单独处理的黑麦草种子内可溶性糖含量突然下降,而加入外源cGMP处理和对照略微升高,变化幅度不明显,加入外源cGMP处理的比对照和100 mmol/L NaCl单独处理的增加了34.3%和47.9%。

图2 外源cGMP对NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响Fig.2 Effects of exogenous cGMP on the soluble protein and sugar content in germinating ryegrass seeds under NaCl stress相同处理天数不同字母表示差异显著(P<0.05)

由图3可知：各处理下的黑麦草种子内淀粉含量均随着处理时间的延长,整体呈现先升高后下降的变化趋势。在处理的第2天,3个处理淀粉含量均达到最大值,分别增加了30.8%、28.6%、9.9%；在处理第4天,各处理之间差异显著(P<0.05),各处理下黑麦草种子内淀粉含量迅速下降；在处理的第6天,不同处理下种子内淀粉含量下降并达到最低点,各处理间差异显著(P<0.05)；其中,加入外源cGMP处理比单独100 mmol/L NaCl处理和对照分别下降了11.3%和50.4%。

由图3可知：各处理下的黑麦草种子内淀粉酶活性均随着处理时间的延长,整体呈现先升高后降低的变化趋势。在处理的第2天,3个处理之间差异显著(P<0.05),其中对照分别比加入外源20 μmol/LcGMP和100 mmol/L NaCl单独处理的淀粉酶活性增加15.3%、24.3%；在处理第4天,3个处理都达到最大值,其中对照组和施加cGMP处理的淀粉酶活性差异不显著,两者比单独100 mmol/L NaCl处理下的分别提高了46.8%和48.6%；在处理的第6天,对照组淀粉酶活性最高,分别比100 mmol/L NaCl和施加cGMP处理下的高69.0%、29.4%,20 μmol/LcGMP与100 mmol/L NaCl共同处理下的比100 mmol/L NaCl单独处理的淀粉酶活性提高了53.2%。说明cGMP促进黑麦草种子内淀粉酶活性,加速了淀粉的水解,为种子萌发提供能量。

图3 外源cGMP对NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中淀粉和淀粉酶活性的影响Fig.3 Effect of exogenous cGMP on the starch contentand amylase activity in germinating ryegrass seeds under NaCl stress

2.4 外源cGMP对盐胁迫下黑麦草种子萌发过程中生理指标的影响

从图4可以看出：CK与100 mmol/L NaCl处理下的黑麦草种子在萌发过程中的MDA含量都呈现上升的趋势,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl呈现先上升后下降的趋势,在处理的第6天达到最大值。在处理的第2天,3个处理之间存在显著性差异(P<0.05)；处理的第4天,100 mmol/L NaCl单独处理的比CK与加入外源cGMP处理的分别增加了3.0倍和1.6倍,3个处理之间存在显著的差异性(P<0.05)；在处理的第6天,100 mmol/L NaCl单独处理比CK与加入外源cGMP处理的分别增加了2.3倍和1.4倍,加入外源cGMP的黑麦草种子内MDA含量达到最大值；在处理的第8天,CK与加入外源cGMP的黑麦草种子萌发过程中MDA含量无明显差异,100 mmol/L NaCl单独处理比CK和加入cGMP处理增加了1.8倍和1.6倍。

由图4可知：随着发芽时间的延长,黑麦草种子萌发过程中脯氨酸含量先上升后下降。盐胁迫增加了黑麦草种子萌发过程中脯氨酸含量,并在第6天达到最大值,而后缓慢下降,在处理的整个过程中始终高于CK；与100 mmol/L NaCl单独处理相比,20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理明显增加了黑麦草种子在萌发过程中脯氨酸含量,在处理的2—8 d,分别提高了1.5、1.5、1.7倍和2.2倍。

图4 外源cGMP对NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中MDA和脯氨酸含量的影响Fig.4 Effect of exogenous cGMP on the MDA content and proline contentin germinating ryegrass seeds under NaCl stress

相对电导率可反映细胞膜受损伤的程度,如图5所示,100 mmol/L NaCl处理明显增加了黑麦草的相对电导率,并且相对电导率随着处理时间的延长而显著增加,而CK变化不明显。20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理黑麦草种子,其相对电导率小于100 mmol/L NaCl单独处理,在处理的第6天和第8天,100 mmol/L NaCl处理的黑麦草的电导率分别比CK和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理增加了1.7、1.4、1.9倍和1.3倍。

由图5可以看出：随着发芽时间的延长,黑麦草种子在萌发过程中H2O2含量呈现先上升后下降趋势,其中在第6天达到最大值,整个处理过程中,各处理之间差异显著(P<0.05)。盐胁迫明显增加黑麦草种子萌发过程中H2O2的积累,而加入外源cGMP能显著降低盐胁迫下H2O2含量的积累,但都比CK积累的H2O2含量高,其中在处理的第6天,100 mmol/L NaCl单独处理的黑麦草种子内H2O2的积累量分别比CK和20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl增加了2.7倍和1.4倍。

图5 外源cGMP对NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中、相对电导率和H2O2含量的影响Fig.5 Effect of exogenous cGMP on the production rate、electrolyte leakage and H2O2 content in germinating ryegrass seeds under NaCl stress

3 讨论

3.1 不同浓度盐胁迫下黑麦草种子萌发

在植物生长的整个生育期中,种子萌发期和幼苗生长期是最重要的两个阶段,其中种子萌发期是盐胁迫响应比较敏感的阶段,决定着作物的生长及产量[25]。盐胁迫影响植物细胞的正常生长代谢过程,导致种子发芽率、发芽势和发芽指数的降低[26]。种子萌发率、萌发势和活力指数均可以反映种子发芽能力。一般情况下,发芽率与种子生活力是一致的[27]。有研究表明,cGMP处理提高了拟南芥的抗盐性,表现在盐胁迫下促进拟南芥的生长和种子的萌发[28]。本试验发现NaCl胁迫对黑麦草种子的作用表现为低浓度促进,高浓度抑制。50 mmol/L的NaCl处理对黑麦草种子萌发有促进作用,而当NaCl浓度高于50 mmol/L时随处理浓度的升高黑麦草种子萌发率降、发芽势、发芽指数和活力指数均呈下降趋势,且对幼苗和幼根生长的抑制作用加强,这同吴海涛等[29]研究结果一致。低浓度的盐溶液对种子萌发具有促进或影响很小,高浓度盐会对种子造成毒害而抑制其萌发,攀瑞萍等[30]认为植物在低盐浓度的生长环境能满足幼苗对水分的需求,所以不会造成盐害,并且盐中无机离子作为渗透调节物质在一定程度上还可以促进根系生长。当NaCl浓度达到250 mmol/L时,黑麦草种子的萌发率为2.5%,种子活力基本丧失。

植物根系形态变化是生理生化变化的外在表象,而形态发生变化也必然引起内在生理生化指标的变化,二者的变化是相辅相成共同作用抵抗逆境。8-Br-cGMP是cGMP的一种膜透性类似物,cGMP作为细胞内的一种第二信使,能调节植物对生物或非生物胁迫的适应性。已有报道指出,黄瓜中cGMP在生长素诱导的侧根生长中起到了重要作用[3]、在绿豆中,cGMP作为H2O2的下游信号促进绿豆不定根的生长[31]。本试验结果表明,20 μmol/LcGMP对100 mmol/L NaCl胁迫下黑麦草种子的发芽率提升作用不明显,但能明显提高黑麦草种子在100 mmol/L NaCl胁迫下的发芽势、发芽指数和活力指数。本试验最重要的发现是外源cGMP能促进盐胁迫下黑麦草种子萌发时根系的生长,同时也能够促进植株的生长。说明cGMP可能是通过促进盐胁迫下的种子根系发育,以此缓解盐胁迫对黑麦草种子萌发时的伤害。

3.2 外源cGMP对盐胁迫下黑麦草种子萌发时物质代谢的影响

种子萌发过程中需要物质和能量来维持其旺盛的生命活动[32]。种子在萌发期间所需要的养料和能量主要来自贮藏物质的转化和利用[33]。种子内主要的贮藏物质为淀粉、脂肪和蛋白质。这些物质在种子萌发过程中水解为简单的营养物质,并运转到生长部位作为构成新组织的成分和产生能量的原料[34]。有研究显示cGMP对花青素和类黄酮合成是必需的[35],cGMP能够调节甘薯叶片中伤害响应因子miR828的表达[36]。说明cGMP参与调节植物的防御响应。本试验结果表明；盐胁迫显著降低了淀粉酶活性,抑制了淀粉的水解,抑制了可溶性糖和可溶性蛋白的增加。加入cGMP能降低种子内淀粉含量,提高淀粉酶活性,增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量。说明,外源cGMP增强了盐胁迫下种子内淀粉酶活性,促进了淀粉水解,淀粉作为种子内的一种暂时的贮藏物质,不断水解为可溶性糖以满足种子萌发生长所需要的营养物质。

3.3 外源cGMP调控盐胁迫下黑麦草种子萌发时脯氨酸、MDA、电导率、、H2O2含量的影响

渗透调节是植物适应盐害环境的一种重要生理机制,脯氨酸在植物渗透调节中起着重要作用,可以清除活性氧,提高抗氧化能力,稳定生物大分子结构,降低细胞酸性,解除氨毒[37]等。本试验研究发现,加入外源cGMP能显著提高盐胁迫下黑麦草种子萌发时的脯氨酸含量,且在处理的不同时间,外源cGMP处理的黑麦草种子内脯氨酸含量都明显高于CK与100 mmol/L NaCl单独处理,这有利于缓解盐害对植物造成的伤害。

植物在受到盐害胁迫时,细胞内活性氧代谢平衡会被破坏从而产生活性氧,造成细胞膜系统的损害,引发或加剧膜脂过氧化的作用,最终产物主要为MDA,并导致植物外渗物质增加,电导率增加。本试验研究发现100 mmol/L NaCl处理黑麦草种子萌发过程中,MDA含量和电导率都明显高于CK；而20 μmol/LcGMP+100 mmol/L NaCl处理的黑麦草种子萌发时MDA含量和电导率显著低于100 mmol/L NaCl单独处理,但都比CK高,说明cGMP通过控制MDA及外渗物质的含量来保护盐胁迫下植物的生长。

4 结论