HPLC法同时测定连翘败毒丸中绿原酸与连翘苷含量
2018-10-18天津市津南区食品药品检验所300350薄一君
天津市津南区食品药品检验所（300350）薄一君
连翘败毒丸是我国传统的中药方剂，主要由金银花、连翘、栀子、黄芩等十余味药组成，具有清热解毒、消肿止痛的功效。金银花中所含绿原酸具有抑菌抗炎，抗病毒，利胆保肝的作用[1]；连翘中所含连翘苷具有抗菌抗病毒的作用[2]。本文通过试验，建立了同时测定连翘败毒丸中绿原酸与连翘苷含量的方法，该方法操作简便、结果准确，可用于对连翘败毒丸的质量控制。
1 仪器与试药
岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，LC solution工作站。迪马C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；梅特勒-托利多AB265-S分析天平；岛津UV2450紫外-可见分光光度计；绿原酸（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413 ），连翘苷（中国药品生物制品检定所，批号：110821-201213 ）；连翘败毒丸由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂提供（批号：B054100、C054118、C054120；规格：每袋装9g）；甲醇、乙腈（色谱纯）、磷酸（分析纯）、水为纯化水。
附表1 梯度洗脱系统
附表2 回收率试验测定结果
附表3 三批样品含量测定结果
2 方法与结果
2.1 色谱条件[3]流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按附表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为327nm（绿原酸），277nm（连翘苷），柱温为40℃，流速为1.0ml/min，进样量10μl。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和连翘苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含绿原酸和连翘苷各约50μg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液：取装量差异项下样品，研细，混匀，取约1g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性样品溶液：取按处方比例及制法制成不含金银花和连翘的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。
2.3 方法学考查
2.3.1 系统适用性试验 按上述色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，以327nm和277nm为检测波长，进样分析，结果表明，绿原酸与连翘苷与相邻杂质峰均能有效分离，且阴性样品无干扰。结果见附图1、2、3。
2.3.2 标准曲线的制备 取绿原酸与连翘苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中分别含绿原酸16.614μg、27.69μg、55.38μg、83.07μg、110.76μg和含连翘苷14.475μg、24.125μg、48.25μg、72.375μg、96.50μg的溶液，按上述色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品浓度（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得绿原酸回归方程：Y =11910.5X+501.9 r=0.9999（n=5）；求得连翘苷回归方程Y =12572.6X+6510.6 r=0.9999（n=5）。结果表明绿原酸浓度在16.614～110.76μg范围内线性良好，连翘苷浓度在14.475～96.50μg范围内线性良好。
附图1 A为绿原酸对照品；B为连翘苷对照品
附图2 A为绿原酸样品；B为连翘苷样品
附图3 A为绿原酸阴性；B为连翘苷阴性
2.3.3 进样重复性试验 取对照品溶液，按上述色谱条件分析，连续进样6次，分别测定对照品溶液中绿原酸和连翘苷峰面积，测得绿原酸峰面积的RSD为0.9%，测得连翘苷峰面积的RSD为1.2%。
2.3.4 重现性试验 取同一批号（B054100）装量差异项下的样品，研细，按“2.2.2”供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定每份样品中绿原酸和连翘苷含量。结果每g样品中绿原酸平均含量为1.557mg，RSD为1.3%，连翘苷平均含量为1.206mg，RSD为1.5%，表明方法重现性良好。
2.3.5 稳定性试验 取已知含量的样品制备供试品溶液，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、10小时，测定样品中绿原酸和连翘苷峰面积，测得峰面积值的RSD分别为0.46%和0.66%，说明样品溶液在10小时内性质稳定。
2.3.6 回收率试验 取绿原酸和连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为含绿原酸0.3692mg/ml、连翘苷0.3860mg/ml的对照品溶液；另取已知含量的样品（B054100），研细，取约0.5g，共9份，精密称定，分别精密加入上述对照品溶液各1.6ml、2.0ml、2.4ml各3份，再加甲醇分别至25ml，制得供回收率用供试品溶液，按上述色谱条件分析，计算回收率，结果绿原酸平均回收率为99.1%，RSD为0.9%；连翘苷平均回收率99.8%，RSD为0.6%。结果见附表2。
2.3.7 样品测定 取3个批号的样品，每批各平行制备2份供试品溶液，测定绿原酸和连翘苷含量。结果见附表3。
3 讨论
参照《中国药典》2010年版一部项下规定，结合光谱扫描，确定采用双波长测定两种成分的含量。通过比较不同流动相比例，筛选出上述最佳试验条件，主成分峰与相邻杂质峰可以有效分离，同时，通过提高并保持有机相的比例，可以将杂质峰洗脱出来。
同时本试验还对提取溶剂和提取方式进行了考察，并最终确定了上述试验条件，该方法操作简便、结果准确，可用于对连翘败毒丸的质量控制。
