HPLC法测定梵净山野生八角莲中黄酮类化合物的含量

陈仕学，鲁道旺，姚元勇，陈美航，程小涛，万 鹏

(铜仁学院，材料与化学工程学院，贵州 铜仁 554300)

八角莲(Dysosma versipellis (Hance) M. Cheng ex Ying 是小檗科八角莲属植物，又称为鬼臼属植物，是我国独特的植物物种[1]。八角莲是用根茎来作为药材，主要是有散热解毒、活血散瘀的功效，还用于乳腺癌肿，发炎症，腮炎肿痛等疾病的治疗[2]。在2011年已经有人从八角莲植物中鉴别了约14个化合物，其中就分离出木质素和黄酮类成分，其中的黄酮类化合物包括槲皮素和山奈酚[3]。槲皮素主要具有抗氧化和消除氧自由基的功效, 能降低血压, 增强免疫功能[4]；山萘酚主要具有预防癌变、癫痫，抗氧化、消炎止咳等作用[5]。

目前，对八角莲的研究主要对鬼鬼臼毒素的研究较多，但关于梵净山野生八角莲黄酮类化合物中槲皮素和山奈酚这两种物质的含量测定还未见报道，本实验主要采用高效液相色谱法测定其槲皮素、山奈酚这两种物质的含量，为本地八角莲药材的开发、利用提供一定的参考依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 实验材料

八角莲药材采购于贵州梵净山，洗干净，用干燥箱烘干，粉碎密封，室温保存备用。

1.2 实验试剂

乙醇、分析纯，甲醇、乙腈、磷酸、槲皮素(>98.5%)、山奈酚色谱纯(>98%)均为色谱纯。

1.3 实验仪器

旋转蒸发仪，电热鼓风干燥箱、移液枪、高效液相色谱、色谱柱、柱温箱、超声波、自动进样器、泵、检测器，日本岛津有限公司。

2 实验方法

2.1 原材料的预处理

先将八角莲洗净，烘干，打成粉末。称取八角莲样品粉末放入烧杯中，同时加入石油醚，样品粉末与石油醚按照1∶5(g/mL)的比例，放置，浸泡3 h后，抽滤后烘干，备用。

2.2 黄酮类化合物的提取以及样品液的制备

2.2.1 提取

称取上述的粉末(由2.1制备)与95%乙醇按照1∶10 (g/mL)的比例放入锥形瓶中，放入60℃电热恒温水浴锅中，加热1 h后进行冷却，并进行抽滤，将所得滤液在40～60℃下进行旋蒸，浓缩至干。此时加入60～70℃的蒸馏水溶解，同时加入几滴无水乙醇进行较好溶解(这个过程需在60℃的热水中进行)，抽滤之后得到滤液，将滤液放置冰箱冷藏24 h，进行重结晶，静置到次日再进行抽滤，放入烘箱烘干(45℃，5～10 min)，得粉末状八角莲总黄酮类物质。

2.2.2 样品液的制备

称取上述物质5 mg于25 mL容量瓶中，滴加甲醇溶解后，用超声处理10 min，之后用甲醇定容摇匀，即得样品液。

2.3 混标贮备液的配制

精密称取两种标准品，其中槲皮素标准品1.5 mg，山奈酚标准品1.4 mg，置4mL 样品瓶中，甲醇溶解，超声处理10 min，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，作为混标贮备液[6]。

2.4 色谱条件中流动相的选择

本次实验流动相采取甲醇-0.4%磷酸水溶液与乙腈-0.4%磷酸水溶液进行选择，通过它们的不同比例和流速对槲皮素和山奈酚混标贮备液以及样品进行分离，每次都在同一色谱条件下(色谱柱：4.6×250mm，5μm；进样20μL；分析波长362nm；柱温25℃)观察分离度和峰形，选择最佳比例与流速。

2.5 标准曲线的制备

精密吸取由上述2.3中的混标贮备液20、40、60、80、100μL，甲醇定容为1mL溶液，配成浓度梯度液。按照最佳色谱条件进样，以槲皮素、山奈酚这两种物质的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.6 精密度实验

精密吸取同一份由上述2.3中的混标贮备液20μL注入高效液相色谱仪，按照最佳色谱条件，连续进样6次，得到色谱图，根据峰面积，计算得到槲皮素和山奈酚分别对应的RSD。

2.7 重现性实验

精密吸取上述2.2中的样品液，平行进样2次，按照最佳色谱条件进行测定，得到色谱图，根据峰面积，计算槲皮素和山奈酚分别对应的RSD。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一样品溶液(由2.2制备)，按照最佳色谱条件，分别在4、8、12、16、20、24h进样20μL，测定槲皮素和山奈酚的含量，计算其对应的RSD。

2.9 样品含量测定实验

精密吸取样品溶液(由2.2制备)，按照最佳色谱条件测定槲皮素和山奈酚的平均含量(n=5)。

2.10 回收率实验

取6份已知含量的样品，每份约0.0437mg，按照上述2.2的方法制备成样品液；精密吸取此样品液500μL，加入混标贮备液(按照2.3制备而成)500μL，按照最佳色谱条件，测定其回收率。并用同样的方法测山奈酚。

3 结果与分析

3.1 色谱条件中流动相的选择

实验的流动相采取甲醇-0.4%磷酸水溶液与乙腈-0.4%磷酸水溶液两种进行选择，通过它们的不同比例和流速对槲皮素和山奈酚混标贮备液以及样品进行分离，观察分离度和峰形，选择最佳比例与流速。

3.1.1 流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液

实验现象见表1。

表1 甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相

3.1.2 流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液

实验现象见表2。

表2 乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相

由表1、表2，可确定最佳色谱条件：流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(35%：65%)，流速为0.7000mL/min，色谱柱为C18 柱(4.6×250mm，5μm)，进样20μL；分析波长362nm；柱温25℃。在此最佳条件下进行实验。

3.2 标准曲线的制备

混标贮备液按照2.5中的方法精密吸取，配制成浓度梯度混标溶液。在3.1中的色谱条件下进样(n=5)，以槲皮素、山奈酚两种物质的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

图1 槲皮素标准曲线

由图1可得：槲皮素回归方程为：Y =7X+5.81311e；槲皮素在0.0075～0.0375 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好(R2=0.9999，n=5)。

图2 山奈酚标准曲线

由图2可得：山奈酚回归方程为：Y=7X+9.23054e；山奈酚在0.007～0.035 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好(R2=0.9998，n=5)。

3.3 精密度实验

在2.6的条件下，连续进样6次，测定峰面积，计算得到槲皮素和山奈酚分别对应的RSD。

槲皮素：计算所得n=6，RSD(槲皮素)=0.56%；山奈酚：计算所得n=6，RSD(山奈酚)=0.58%，结果说明仪器精密度良好。

3.4 重现性实验

由2.7中的条件平行进样2次，计算得到槲皮素和山奈酚分别对应的RSD。

槲皮素：计算所得，RSD(槲皮素)= 0.27%；

山奈酚：计算所得，RSD(山奈酚)= 0.22%，表明此方法重现性良好。

3.5 稳定性试验

由2.8中的条件24h内，每4h进样一次(n=6),测定槲皮素和山奈酚的含量，计算其对应的RSD。

槲皮素：计算所得，RSD(槲皮素)= 0.21%；

山奈酚：计算所得RSD(山奈酚)= 0.18%，结果表明在24h内对样品溶液进行检验，对结果无影响，稳定性良好。

3.6 样品含量测定实验

在2.9的条件下，测定槲皮素和山奈酚这两种物质的平均含量。

表3 样品平均含量

由表3可得：在八角莲黄酮类化合物中槲皮素平均含量为5.92%，山奈酚平均含量为1.95%。

3.7 回收率实验

由2.10中的条件，测定的回收率。

表4 槲皮素的回收率

表5 山奈酚的回收率

由表4、表5可知：槲皮素的回收率为100.90%，RSD为2.49%；山奈酚的回收率为101.07%，RSD为3.81%。

3.8 不同产地八角莲黄酮类化合物中槲皮素和山奈酚含量比较

表6 不同产地八角莲黄酮类

由表6可知，不同产地八角莲黄酮类化合物的槲皮素和山奈酚的含量有所不同，其中梵净山的比其他地方的含量高，但贵州黔南的与梵净山十分接近。

4 结论

本文用高效液相色谱法对八角莲中槲皮素和山奈酚这两种物质的含量进行测定，根据两种化合物的分离度、出峰时间以及峰形不同，确定了这次实验的最佳色谱条件：流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(35%:65%)，流速为0.7000mL/min，色谱柱为C18 柱(4.6×250mm，5μm)，进样量20μL；分析波长362nm；柱温25℃。由此可知：八角莲黄酮类化合物中槲皮素的含量为5.92%，山奈酚的含量为1.95%，这说明了再八角莲中槲皮素和山奈酚的含量偏少。通过精密度、重现性、稳定性、回收率等实验，证明用高效液相色谱法测定八角莲中槲皮素和山奈酚的含量时，其优点在于：精密度好，稳定性高，八角莲原材料预处理方法简单，二者的分离度好，最佳条件下，没有其他成分干扰，这为贵州本地的八角莲药材的质量控制、开发等提供了有用的参考价值。