羊火腿风干成熟期间蛋白质、脂肪氧化以及相互影响

木卡代斯·木合旦尔，决肯·阿尼瓦什，巴吐尔·阿不力克木*

1(新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐,830052) 2(新疆农业大学 动物科学学院，新疆 乌鲁木齐,830052)

干腌羊火腿是世界各地国家人民喜爱的肉类产品之一。新疆羊火腿借鉴阿拉伯地区羊火腿加工方法，结合新疆少数民族饮食习惯，腌制、风干、成熟而制成的腌腊肉制品。羊火腿的加工过程包括：原料羊腿的选用→修腿→腌制→清洗→风干成熟→包装等工序。火腿的成熟发生在整个风干过程[1]，风干成熟期间，肌肉蛋白质经历一系列的物理化学变化影响其稳定性，从而导致火腿的营养和感官特性变化。

肌肉组织中富含亚铁血红素、不饱和脂肪酸、金属催化剂等促氧化因子。因此，在肉类宰后成熟、加工、运输及贮藏过程中，肌肉组织极易被氧自由基攻击[2]。蛋白质氧化引起蛋白质构象和功能的变化以及共价分子间交联蛋白衍生物的形成，肽键的切割和氨基酸侧链的修饰(羰基化)(疏基化)等[3-7]。羰基化合物的形成是在蛋白质氧化过程发生的最明显的变化之一[8-9]，通常作为评价蛋白质氧化(P-OX) 程度的指标[10]。蛋白质羰基化的形成是特定氨基酸残基发生反应以及金属催化氧化的结果，铁以及肌红蛋白被认为肉类体系中蛋白质羰基化的主要贡献者[4]。适度的蛋白质氧化有助于提高肉的成熟度，但肌肉蛋白质在成熟过程过度氧化，导致肌肉色泽、风味、保水性及质构特性的恶化、肌肉嫩度的下降以及必需氨基酸的损失等不良后果。

肉制品中的脂肪主要由甘油酯、磷脂和游离脂肪酸三部分组成，其中游离脂肪酸含量所占的比例最小。根据氧化机理的不同，脂肪氧化分为酶促氧化和非酶促氧化。酶促氧化是原料在脂肪酶作用下脂肪氧化成游离脂肪酸、多不饱和脂肪酸，进一步被脂肪酶氧化而生成氢过氧化物[11]。腊肉的酶促氧化主要是脂肪氧合酶催化不饱和脂肪酸的反应[12]，脂质氧化所产生的低分子化合物有助于火腿风味物质的形成。许多研究表明，食品中NaCl含量、加工储藏温度会影响脂质氧化[13-14]，脂肪氧化严重导致羊火腿颜色的恶化，臭味影响羊火腿的感官品质。

本实验通过测定羊火腿风干成熟期间蛋白质氧化、脂肪氧化和相互影响，以及羊火腿风干成熟期间色度的变化与蛋白质氧化、脂肪氧化的相关性分析，为改善羊火腿产品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用宰后24 h以内的鲜羊腿12条，每条羊腿重量为 2.5～3 kg，由乌鲁木齐市沙依巴克区新朱兰清牛羊肉配送中心提供；食盐、亚硝酸盐、蔗糖、调料等，由市场购置。

浓H2SO4，H3BO3，KCl，K3PO4，MgCl2，叠氮化钠，牛血清蛋白，三氯乙酸，HCl，2,4二硝基苯肼，乙醇，乙酸乙酯，盐酸胍，尿素缓冲液，1,1,3,3-四乙氧基丙烷。

1.2 仪器与设备

索氏提取器,JA2003max200型分析天平,上海上天精密仪器有限公司；GL-20GⅡ低温离心机,上海安亭科学仪器厂；H18399型高速均浆机,北京恒奥德仪器仪表有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅,金坛市医疗仪器厂；JZ-350便携式色彩色差仪,苏州艾森仪器设备有限公司；721型紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司；DHG-3923A电热恒温干燥箱,上海恒科技机器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊火腿的制作

加工工艺：

原料羊腿的选用→修腿→腌制→清洗→风干前期→风干中期→风干后期→成熟期。

工艺条件：将预处理之后的原料羊腿按腌制料配比用食盐5%、硝酸盐0.2%、蔗糖0.5%，在温度4～8 ℃，湿度85%～90%条件下腌制3 d；风干前期：5 d(10～12 ℃、湿度80%～85%、风速0.8 m/s)；风干中期：7 d(10～12 ℃、湿度75%～80%、风速0.8 m/s)；风干后期：8 d(14～15 ℃、湿度75%～85%、风速0.8 m/s)；成熟期：7～10 d(16～18 ℃、湿度70%～75%、风速0.5 m/s)；取样点分别为原料羊腿(第0天)、腌制结束期(第3天)、风干前期(第8天)、风干中期(第15天)、风干后期(第23天)、成熟期(第30天)总共取6次样，放置 -20 ℃ 冷冻保藏，检测时解冻使用。

1.3.2 总氮含量的测定

凯氏定氮法。

1.3.3 脂肪含量的测定

索氏提取法。

1.3.4 羊火腿风干成熟期间蛋白质氧化的测定

1.3.4.1 肌原纤维蛋白的提取

将肉羊剪碎研磨后，取去除筋腱和结缔组织后的肉样10 g ，加入8倍体积的标盐溶液，用高速均浆机匀浆10 s，离心(1 000×g，10 min)，弃上清液，沉淀按上述操作重复离心3次，弃上清液，沉淀中加入6倍体积的含有曲拉通X-100标准盐溶液匀浆，离心(2 000×g，5 min)2次。沉淀中加入5倍体积的标准盐溶液，(10 000×g，10 min)低温离心，重复2次。用6倍体积的100 mol/mL的KCl降速离心2次，用5倍体积的100 mol/mL的NaCl洗涤2次，得到的肌原纤维蛋白，用考马斯亮蓝法测定浓度，采用牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.3.4.2 羰基含量的测定

参照OLIVER[15]和GANHO[16]的方法并做修改，取2份0.2 mL的质量浓度为10 mg/mL的蛋白质溶液，放入2 mL的离心管中，用4 ℃的1 mL 20 g/L的三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，620×g离心5 min，对照组用1 mL 2 mol/L的HCl处理，待测组加入等量体积的2 g/L的DNPH，室温放置1 h。用1 mL 20 g/L的TCA沉淀样品，用1 mL的乙醇和乙酸乙酯混合液(体积比1∶1)洗涤2次以除去过量的DNPH，将沉淀溶解于含有6 mol/L盐酸胍、120 mol/L (pH 6.5)的磷酸钠缓冲液中，搅拌并620×g离心3 min除去不溶性物质。在370 nm波长下测定溶液的吸光度值，羰基含量表示为nmol DNPH/mg，蛋白质腙的吸收系数为21.0 nmol/L·cm。

1.3.4.3 总巯基含量的测定

将蛋白液稀释至2 mg/mL，与尿素缓冲液按1∶1比例溶解，孵育后加入0.5 mL DTNB试剂，在室温下反应 15 min，在λ为412 nm处测吸光度。空白组加入0.5 mL 不含DTNB的缓冲液。巯基含量(nmol/mg蛋白质)使用摩尔吸光系数11 400 mol/L·cm计算。每组样品测量3个平行，结果取平均值。

1.3.5 羊火腿风干成熟期间脂质氧化的测定

1.3.5.1 硫代巴比妥酸的测定

1.3.5.2 过氧化值的测定

按 GB/T5009.37—2008 的方法测定。

1.3.6 色度的测定

将肉羊切成切面平整，圆柱形盛放器一样大的薄片，随机选择3个位置进行测定。颜色指数：L*(亮度)，a*(红度)和b*(黄度)。

C(彩色值)=(a*2+b*2)0.5

(1)

(2)

1.3.7 数据分析

用SPSS 18.0统计软件进行方差分析以及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 羊火腿风干成熟期间总氮含量变化

羊火腿风干成熟期间总氮含量变化见图1。

图1 羊火腿风干成熟期间总氮含量的变化Fig.1 Changes in total nitrogen content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间总氮含量变化差异显著(p<0.05),大写字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

由图1可知，羊火腿在风干成熟期间总氮含量呈先下降后上升的趋势，腌制结束3 d的总氮含量最低(8.15%)差异显著(p<0.05)，原因可能是腌制过程中水溶性蛋白随盐水渗出而析出导致蛋白质含量的下降。在后续加工过程蛋白质含量逐渐上升，这与大部分腌腊肉制品风干过程总氮含量变化趋势一致。

2.2 羊火腿风干成熟期间脂肪含量变化

羊火腿风干成熟期间脂肪含量变化见图2。

图2 羊火腿风干成熟期间脂肪含量的变化Fig.2 Changes in fat content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间脂肪含量变化差异显著(p<0.05),大写字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

由图2可知，羊火腿在风干成熟期间脂肪含量呈上升趋势，风干期间脂肪含量差异不显著(p<0.01)，风干后期和成熟期的差异不显著(p>0.05)，风干成熟期间水分含量的下降，导致干物质含量上升，因此也导致脂肪含量上升。研究结果与郭黎洋[18]山羊火腿总脂肪含量变化趋势一致。

2.3 羊火腿风干成熟期间蛋白质氧化情况

2.3.1 羊火腿风干成熟期间羰基含量变化

羊火腿风干成熟期间羰基含量变化见图3。

图3 羊火腿风干成熟期间羰基含量的变化Fig.3 Changes in Carbonyl Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间羰基含量变化差异显著(p<0.05),大写字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

蛋白质作为生物体的重要组成部分，普遍存在于细胞内外，极易被氧自由基攻击，肌肉蛋白质氨基酸侧链的氧化导致羰基产物积累。相关研究显示，羰基含量随着氧化程度的增加而增加[19-20]。由图3得知，羊火腿风干成熟期间羰基含量由原料羊腿的1.07 nmol/mg蛋白(p<0.05)至成熟期30 d的4.72 nmol/mg蛋白(p<0.05)，呈先上升后下降的趋势，该结果说明在羊火腿风干成熟期间活性氧自由基使羊火腿蛋白质的氨基酸侧链NH—或NH2—基团部分转化为羰基基团，导致羰基含量随着蛋白质氧化程度的增大而上升。腌制结束3 d和风干前期8 d的羰基含量差异显著(p<0.05)，原因可能是腌制结束后，羊腿的盐含量的上升破坏细胞膜的完整结构，导致蛋白质分子结构疏松，易受活性基团的攻击。

2.3.2 羊火腿风干成熟期间总巯基含量变化

羊火腿风干成熟期间总巯基含量变化见图4。

肉制品中的蛋白质氧化可直接由活性氧和活性氮或间接由二级氧化产物诱导发生[21]。肌球蛋白是原纤维蛋白的主要组成蛋白，占肌原纤维蛋白的50%，肌球蛋白分子疏基量约有42个，肌动蛋白的疏基量约有12个，半胱氨酸结构中的巯基是肌原纤维蛋白中反应活性最强的功能基团，蛋白质氧化导致巯基含量的变化。由图4得知，羊火腿风干成熟期间巯基含量从原料羊腿的42.06 nmol/mg至成熟期30 d的24.24 nmol/mg,呈下降趋势，各阶段差异显著(p<0.05)。此结果表明，羊火腿风干成熟期间肌原纤维空间结构受到氧化因子的破坏，导致内部易氧性疏基的暴露，以及疏基含量的下降，此结果进一步地确认羊火腿风干成熟期间蛋白质氧化的存在以及不同的风干阶段氧化程度的变化。

图4 羊火腿风干成熟期间巯基含量的变化Fig.4 Changes in mercapto content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间巯基含量变化差异显著(p<0.05),大字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

2.4 羊火腿风干成熟期间脂肪氧化情况

2.4.1 羊火腿风干成熟期间硫代巴比妥酸的变化

羊火腿风干成熟期间硫代巴比妥酸的变化见图5。

图5 羊火腿风干成熟期间丙二醛含量的变化Fig.5 Changes in Malondialdehyde Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间丙二醛含量变化差异显著(p<0.05),大字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

脂肪氧化过程中产生的氢过氧化物进一步分解为低分子的醛、酮等风味物质，其中丙二醛(MDA)与α-硫代巴比妥酸(TBA)试剂反应形成红色的复合物，因此通过检测丙二醛含量的变化能表现出脂肪氧化程度。由图5得知，羊火腿风干成熟期间，丙二醛含量呈上升趋势，丙二醛含量由原料腿的0.06 mg/kg至风干前期8 d的0.09 mg/kg，快速上升，差异显著(p<0.05)。ZHOU等[22]发现盐对肉制品减缓蛋白水解和脂肪分解的作用，但对干腌火腿促进脂质氧化的作用，通过研究羊火腿腌制结束的丙二醛含量变化也得出相似的结论。风干中期15 d丙二醛含量有所下降，原因可能是不稳定的丙二醛被降解成挥发性化合物或与蛋白质的游离氨基酸进行反应。

2.4.2 羊火腿风干成熟期间过氧化值的变化

羊火腿风干成熟期间过氧化值的变化见图6。

图6 羊火腿风干成熟期间过氧化值的变化Fig.6 Changes in POV Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿风干成熟期间过氧化值变化差异显著(p<0.05),大字母表示变化差异极显著 (p<0.01)。

在风干时间以及加工条件的影响下，脂肪氧化形成多种过氧化物。过氧化值是脂肪氧化一级产物，衡量脂肪氧化的重要指标，过氧化值高说明脂肪氧化中间产物积累的多，但这些过氧化物随着积累很快进入下一步氧化反应生成醛、酮、酸等低分子物质[23-24]，因此随着加工时间的延长，过氧化物逐渐分解。由图6得知，羊火腿在风干成熟期间风干条件等因素的影响下过氧化值从原料羊腿的0.75 mep/kg至风干前期8 d的7.92 mep/kg,逐渐上升，各阶段差异显著(p<0.05)，风干中期15 d的9.47 mep/kg的至成熟期30 d的8.39 mep/kg，慢慢下降，各阶段差异显著(p<0.05)，原因可能是羊火腿风干成熟期间积累氢过氧化物，随着风干时间生成醛、酸、酮等物质导致过氧化物质的减少。

2.5 羊火腿风干成熟期间色度的变化

肌肉颜色变化主要取决于肌肉肌红蛋白和血红蛋白的含量变化[4]。影响肉制品颜色的因素有原料肉的品种、肌肉种类、性别、饲料状况、加工方式和条件、加工过程所添加的辅料类型和配比、蛋白质水解、脂肪和蛋白质氧化程度等。由表1得知，羊火腿风干成熟期间亮度先上升后下降，变化趋势跟蛋白质氧化趋势一致。红度从原料羊腿至腌制结束3 d呈下降趋势(p<0.05)，从风干前期8 d至成熟期30 d逐渐回升(p>0.05)，原因可能是肌红蛋白的氧化导致火腿红度的下降，后续加工过程随着火腿的成熟，肌肉组织会形成红色亚硝酰基肌红蛋白[25]，因此羊火腿的红度逐渐回升。羊火腿风干成熟期间黄度的变化不明显，原料羊腿和成熟期30 d的黄度值差异不显著(p>0.05)，腌制期3 d至风干后期23 d差异不显著(p>0.05)。

表1 羊火腿风干成熟期间色度的变化Table 1 Changes in color during drying maturation process of dry cured sheep ham

注：不同字母表示羊火腿腌制、风干期间色度变化差异显著(p<0.05)。

2.6 羊火腿风干成熟期间脂肪氧化，蛋白质氧化与色度的相关性分析

由表2可知，总氮含量与脂肪含量、羰基含量和亮度呈显著正相关(p<0.05)，脂肪含量变化与羰基值、疏基值、丙二醛含量、过氧化值呈极显著正相关(p<0.01)，跟颜色改变值呈显著正相关(p<0.05)，因为脂肪含量的变化影响脂肪在风干成熟期间的氧化情况。羰基值与疏基值、过氧化值含量和黄度呈极显著正相关(p<0.01)，蛋白质氧化导致蛋白质结构易氧化氨基酸结构的破坏影响疏水值的变化。疏基值与丙二醛含量和过氧化值的变化呈显著正相关(p<0.01)。虽然脂肪和蛋白质氧化反应途径不同，但2种反应都受到类似促氧化剂和抗氧化因子的影响，其次脂质氧化过程所产生的次级产物如醛类易导致蛋白质氧化[26]，从表2也得出相似的结论。丙二醛含量和过氧化值及颜色改变值呈极显著正相关(p<0.01)，大量文献提出肉制品的氧化会导致色度的变化，影响产品的感官特性。由表2可知，羊火腿风干成熟期间颜色改变值跟羊火腿羰基含量呈显著正相关(p<0.05)，疏基含量呈极显著正相关(p<0.01)。FAUSTMAN[27]研究发现，肌肉高铁肌红蛋白含量与脂质氧化和蛋白质氧化作用紧密相关，动物死后，高铁肌红蛋白还原酶被耗尽后，高铁肌红蛋白无法按正常代谢途径被还原为脱氧肌红蛋白，逐渐积累增多，造成肉品蛋白质氧化变性，高铁肌红蛋白含量积累越高，氧化速率越快。VENTANAS等[28]提出，脂肪氧化促进肌红蛋白氧化，结果火腿蛋白质氧化影响火腿颜色的变化。通过研究羊火腿风干成熟期间的脂肪、蛋白质氧化以及氧化对羊火腿颜色的变化也得出相似的结论。

表2 羊火腿风干成熟期间脂质，蛋白质氧化与色度的相关性分析Table 2 Correlative analysis of lipid, protein oxidation to color changes during drying maturation process ofdry cured sheep ham

注：*.显著相关(p<0.05)；**.极显著相关(p<0.01)。

3 结论

羊火腿风干成熟期间蛋白质氧化，脂肪氧化始终存在，腌制阶段和风干前中的蛋白质、脂肪氧化比风干后期和成熟期剧烈，风干后期和成熟期缓慢下降，此阶段亮度和红度的变化比较明显。

通过羊火腿风干成熟期间脂肪氧化，蛋白质氧化与色度变化相关性分析得知，羊火腿风干成熟期间脂肪氧化过程所产生的中级和次级产物促进蛋白质氧化，蛋白质氧化通过高铁肌红蛋白的积累和氧化影响火腿色度的变化。在羊火腿加工过程，通过抑制脂肪氧化，不仅能抑制羊火腿氧化酸败，还能防止火腿在加工期间蛋白质氧化所导致的产品品质恶化和色度的变化。