乳酸菌发酵对桑葚浆品质及抑菌性能的影响

苏能能，关倩倩，彭珍，肖阳生，于红，程浩，熊涛

(南昌大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验，江西 南昌，330031)

桑葚，又名桑椹子、桑枣、桑果，具有美容养颜[1]、生津润燥、乌发明目[2-3]、补肝益肾[4]等功效。目前的研究多侧重其保健成分花青素、多糖等[5-7]，而益生菌发酵桑葚加工方面的研究随着益生菌发酵产品的火热也越来越多。近年来，徐辉艳等人[8]用葡萄酒酵母BM45和ASL41醋酸菌发酵桑葚，优化发酵工艺得到保健型果醋；黄星源等人[9]利用酵母菌对桑葚进行发酵，得到品质优良的桑葚果酒；邱怡筠等人[10]利用酵母菌对桑葚、草莓复配物发酵，得到桑葚草莓复合果酒等。然而，以桑葚为原料，利用乳酸菌发酵桑葚的研究还较少，软饮料行业有必要增大对桑葚的开发。

本实验以乳酸菌发酵桑葚浆为对象，分析发酵前后桑葚浆品质及抑菌性能的变化，为桑葚发酵制品及相关产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

桑葚，品种黑珍珠，采购于上海浦东区白鹤镇白石公路兴利路采摘园，位于东经121°08′、北纬31°15′；植物乳杆菌(NCU137)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、大肠杆菌(CMCC 44350)、铜绿假单胞菌(CMCC 10104)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 13311)，由食品科学与技术国家重点实验室提供。

1.2 仪器与设备

ZSD-A1160A全自动新型生化培养箱，上海精宏试验设备有限公司；YXQ-LS50SⅡA/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；实验室pH计FE30，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Aglient1260液相色谱，美国Agilent公司；精密电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；S-443D型氨基酸分析仪，德国塞卡姆公司；苏泊尔SJ201A-250型榨汁机，浙江苏泊尔股份有限公司；Agilent 7890/7000A三重串联四级杆气质联用仪，美国Agilent公司；手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB /CAR/PDMS57328-U萃取头，美国Supelco公司；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵桑葚浆样品的制备

解冻已清洗、去杂的桑葚鲜果，去梗后置于打浆机中打浆。将果浆装瓶后102 ℃灭菌20 min[11]，冷却至室温，接种活化后的植物乳杆菌(NCU137)，接种量为0.03‰(m/m)，37 ℃恒温发酵60 h，定期取样。以打浆后的新鲜桑葚浆作为对照组，于-18 ℃冰箱中冻存。

1.3.2 理化指标的测定

1.3.2.1 活菌数与pH值的测定

采用梯度稀释平板涂布法测定植物乳杆菌(NCU137)活菌数，果浆pH值由pH计直接测得。

1.3.2.2 糖类及乳酸的测定

糖类及乳酸的测定参照XIONG[12]等的方法并略作改进。样品经12 000 r/min低温离心10 min后，将上清液过0.45 μm水系滤膜，取滤液上液相测定。色谱条件：Aminex HPX-87H色谱柱；流动相为5 mmol/L的硫酸水溶液；流速0.5 mL/min；柱温35 ℃；紫外检测器波长210 nm；手动进样，进样量20 μL。示差检测器测定蔗糖、葡萄糖、果糖，紫外检测器测定乳酸、柠檬酸。

1.3.3 游离氨基酸的测定

果浆经3 000 r/min低温离心5 min，准确取上清液1 mL加20 g/L的磺基水杨酸9 mL混匀、静止15 min后离心留上清过膜(0.45 μm)得待检液。待检液上氨基酸分析仪，检测参数：流动相柠檬酸钠溶液(A0.12 mol/L pH 3.45；B0.2 mol/L pH 10.85)；检测波长510 nm、440 nm；茚三酮反应显色；58～74 ℃梯度控温，45 min标准解析。

1.3.4 香气成分测定

利用固相微萃取结合气相色谱/质谱联用技术(SPME-GC-MS)测定桑葚浆发酵前后的香气成分。

1.3.4.1 香气的萃取

参照陈娟[13]、吴琼[14]、刘玮[15]等的方法略作改进，精确称取6 g果浆样品于顶空瓶中，瓶身置于45 ℃恒温水浴锅中水浴30 min，将预先老化的萃取针(50/30 μm DVB/CAR)插入顶空瓶，持续恒温萃取30 min，取出萃取头并手动进样送至GC-MS中，250 ℃解析5 min。

1.3.4.2 GC-MS检测条件

根据刘玮[15]等的方法，色谱柱：HP-5MS毛细管柱；升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至240 ℃，保持2 min；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；不分流进样。质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式EI，离子能量70 eV，质量扫描范围为20～350 U。

1.3.4.3 气成分的定性定量

香气成分采用Wiley7n.1质谱数据库检索并结合参考文献[13-15]进行定性分析。用峰面积归一化法进行各种香气成分相对含量的计算，即各种香气物质的峰面积占总挥发性成分总出峰面积的百分数。每个样品重复3次，各种香气成分相对含量取平均值。

1.3.5 桑葚浆发酵前后抑菌性能的变化

1.3.5.1 指示菌与样液的制备。

(1)指示菌制备：LB液体培养基培养指示菌，37 ℃恒温培养20 h，指示菌稀释合适梯度，平板涂布使指示菌浓度107CFU/mL以上。

(2)样液制备：称取果浆20 g，4 500 r/min离心10 min留上清，过0.45 μm膜备用。

(3)阳性组：精确称取0.1 g青霉素钠(80万单位，简写Amp)，蒸馏水稀释配成50、100 μg/mL两种溶液，分别标记为Amp50、Amp100。

1.3.5.2 抑菌性能的测定[16]

将4种指示菌均匀涂布于LB固体培养基上，轻放牛津杯。取200 μL样液分别加入牛津杯中(n=3)，平稳轻移至培养箱37 ℃培养12 h。游标卡尺测其抑菌圈直径作为指标，探究产品抑菌性能，Amp50、Amp100为阳性对照。抑菌直径均以3次实验的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 桑葚浆发酵前后理化指标的分析

2.1.1 桑葚浆发酵过程中pH值与活菌数的动态变化

活菌数与pH值的动态变化是衡量桑葚发酵的基础参数，其动态变化见图1。

图1 发酵桑葚过程中pH值与活菌数的动态变化Fig.1 Dynamic change in pH value and viable cell counts during mulberry fermentation

由图1可知桑葚接种NCU137初始浓度为1.85 ×107CFU/mL；经短暂的调整后进入对数期，在24 h进入稳定期约为1.08 ×1010CFU/mL；发酵结束时植物乳杆菌NCU137(简称NCU137)的活菌数仍保持1010CFU/mL。在发酵体系中随着NCU137大量增殖，果浆的pH迅速降低：当NCU137处于延滞期时pH值降低微弱，由4.17降低到4.15；进入对数期后，pH值由4.15迅速降低至3.65；达到稳定期时，pH值趋于平稳为3.51。这种变化趋势表明NCU137能够在桑葚浆中大量增殖，且在较低的pH环境下仍具有很强的耐受性及存活力。此外，高浓度的活菌数表明乳酸菌发酵桑葚具有开发活菌产品的潜力。

2.1.2 桑葚浆发酵前后糖类与有机酸的变化

以桑葚浆为基底，通过乳酸菌的代谢，糖类被不同程度的消耗，乳酸逐渐积累(表1)，色谱图见图2(A、C鲜果浆，B、D发酵浆)。图2显示，桑葚浆中3种糖类均出现不同程度的降低，柠檬酸略有降低，乳酸增加显著。鲜果浆中葡萄糖含量最高，为17.4 g/L，其次是果糖15.57 g/L，蔗糖含量较少0.31 g/L；在发酵浆中通过NCU137的消耗，发酵结束时葡萄糖浓度降低至10.69 g/L，降低了6.71 g/L；果糖的消耗量为5.82 g/L，略低于葡糖；在发酵体系中蔗糖变化不显著，可能因为有单糖的存在且含量是蔗糖的30多倍，所以在整个体系中乳酸菌对蔗糖利用很少。柠檬酸是桑葚的主要有机酸之一[17]，在鲜果中含有5.25 g/L，发酵后降低到3.69 g/L，可能是参与了风味物质的形成或转化为乳酸[18]。乳酸是乳酸菌产生的代谢产物，由发酵前的3.13 g/L，增加至19.86 g/L。仅从糖酸转化的角度考虑，理论上消耗的糖类转化为乳酸的量约为12.60 g/L。即使包括柠檬酸的转化，理论上乳酸的产量仅为14.16 g/L，这种现象说明桑葚中产生的乳酸并不完全来自葡萄糖、果糖、蔗糖、柠檬酸，可能来自氨基酸的转化，其他糖类的降解。这种转化可能是乳酸积累到一定程度导致pH值降低抑制了葡萄糖相关的酶系同时激发了氨基酸、脂类、其他多糖类等相关的酶系参与能量的供应[19-21]。

表1 桑葚发酵前后主要有机酸与糖的变化Table 1 Change of major organics and glucide after fermentation of mulberry

注：表中不同字母标注代表存在显著性差异，相同字母代表无显著性差异，下同。

1-蔗糖；2-葡萄糖；3-果糖；4-柠檬酸；5-乳酸图2 桑葚浆发酵前后主要糖类、有机酸液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of major saccharides, organic acids before and after mulberry fermentation

2.2 桑葚浆发酵前后游离氨基酸的变化

对微生物而言，游离氨基酸不仅为机体提供能量，而且是生化反应中香气成分形成的一个重要来源[22]。桑葚浆发酵前后游离氨基酸的变化见表2，结果显示了鲜果浆、发酵中期(发酵浆30 h)、发酵结束(发酵浆60 h)3个阶段游离氨基酸的变化。由表2可知新鲜浆果中游离氨基酸总量约为88.10 mg/100 g，发酵30 h后降低至69.72 mg/100 g、结束时为68.98 mg/100 g，整体下降19.12 mg/100 g。在检测的14种氨基酸中，半胱氨酸在鲜果中未检测到(图3-A)而在发酵浆中出现(图3-B)，最终含量为0.80 mg/100 g((图3-C)。整个发酵体系中，除蛋氨酸、谷氨酸外其他12种氨基酸均有显著变化。其中丝氨酸含量最高，在原料中占总量的39.25%为34.58 mg/100 g，发酵后降低至29.38 mg/100 g，占总量的42.59%。丝氨酸可能通过去氨基作用生成α-酮酸，随后参与一系列的反应转化为有机酸、醇、酯类等成分[19]。丙氨酸虽然在含量上不高，但整个发酵过程中降低了5.80 mg/100 g,变化量最大，可能通过脱氨基作用转化为丙酮酸随后参与乳酸的生成[19,21]。总之，桑葚发酵前后游离氨基酸的变化体现了它们参与三羧酸循环(TCA循环)、乳酸生成及挥发性成分代谢的一种可能与潜力。

表2 桑葚发酵前后游离氨基酸的变化Table 2 Change of free ammo acids after fermentation of mulberry

A-鲜果浆；B-发酵浆(30 h)；C-发酵浆(60 h)图3 桑葚浆发酵前后氨基酸色谱图Fig.3 Amino acid chromatogram of different stage in mulberry fermentation

2.3 桑葚浆发酵前后挥发性成分的变化

挥发性成分是产品感官质量的重要指标，也是产品被消费者认可的重要因素之一，备受研究者关注。桑葚的品种有很多，本研究中所用的品种黑珍珠的挥发性成分主要包括酯类、醇类、烯酸类和其他，如表3所示。其中1-己醇-4-甲基乙酸酯、丁酸乙酯、2-甲基戊酸甲酯、3-甲基-1-戊醇、(Z)-8-甲基-4-十一碳烯等是鲜果的主要特征香气成分，相对含量分别是11.859%、11.923%、9.827%、40.263%、5.911%占挥发性成分的79.783%，它们构成黑珍珠的骨架香气体系。鲜果中检测到26种挥发性成分，经乳酸菌作用后16种挥发性成分消失，与此同时20种鲜果中未有的挥发性成分通过代谢产生。在发酵浆中棕榈酸乙酯、甲基十四烷基碳酸酯、2-甲基戊酸甲酯、丁酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、沉香醇、5-甲基-1-己醇、2-异丙基-5-甲基己酯乙酸等8种化合物构成其关键致香成分，相对含量为7.382%、3.120%、9.730%、3.219%、48.838%、1.196%、4.316%、3.114%占总含量的80.915%。果浆经乳酸菌发酵后酯类由45.311%降至34.553%，醇类42.090%升至56.996%，这两类物质是构成香气变化的主要成份，对该品种桑葚特征香气具有显著贡献。

注：ND表示未检测出

酯类是果香中常见的一类挥发性成分，给人愉悦诱人的气味体验。在桑葚发酵前后酯类种类最多且变化显著：种类虽然前后均为14种，但仅有5种相同，在整体上由45.311%降低到34.553%。桑葚中的丁酸乙酯具有香蕉、苹果、凤梨香[24]，经发酵作用降低了8.704%，可能是原料在加工过程中受热扩散所致；棕榈酸乙酯呈微弱蜡香和奶油香，发酵后由1.535%上升至7.382%，可通过醇类与有机酸酯化作用生成[25]。2-甲基戊酸甲酯具有浆果、菠萝蜜、甜瓜等果香[26]，是桑葚的主体香。虽相对含量发酵前后变化不明显，但在发酵浆中是含量最高的酯类物质，表明加工后保留了桑葚固有的香型。醇类是该品种桑葚相对含量较高的一类，鲜果40.263%、发酵浆48.838%。与酯类不同，醇类种类相对较少，鲜果中仅有5种醇类。鲜果中的沉香醇、4-萜品醇、3-甲基-1-戊醇，在发酵后均有所增加，其他2种醇类消失，新产生了5种醇类。3-甲基-1-戊醇是桑葚相对含量最高的一种挥发性成分，发酵前40.263%上升到48.838%。醇类化合物的增加由乳酸菌发酵产生，可能来源于果浆或菌体的蛋白质及氨基酸受酶系作用发生脱氨、脱羧从而降解生成醇类，也有可能来源于糖类，其通过糖酵解产生的丙酮酸进入TCA循环进而参与氨基酸转化、有机酸传递、醇类、酯类等成分形成与演变[20,27-28]。醇类是酯类化合物的前驱物质，其香气特征主要是水果香和花香[29]，如桑葚发酵后产生的沉香醇属于链状萜烯醇类，是在香料使用普遍的一种物质，具有铃兰香气[30]。

2.4 桑葚浆发酵前后抑菌性能变化

抑菌性能有助于产品的保存。桑葚发酵浆前后的抑菌性变化见图4。桑葚鲜果本身因含有机酸和花青素而具有抑菌效果[31]，但因其糖含量高、pH值偏高故抑菌效果不佳。图4可知，鲜果浆对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌4种致病菌均有抑制作用，抑菌圈分别为14.74±0.39、13.78±0.37、12.57±0.38、13.36±0.07 mm。桑葚浆发酵后抑菌性能显著增强，抑菌圈分别为22.82±0.49、24.34±0.38、24.18±0.18、17.71±0.45 mm，变化极显著。桑葚浆通过乳酸菌发酵产生了大量的抑菌物质如：乳酸、细菌素、胞外多糖、小肽等增强了果浆的抑菌性能[32-33]。把发酵桑葚浆的抑菌性能换算成青霉素钠当量：在抑制鼠伤寒沙门氏菌(沙门)方面，发酵桑葚浆抑菌性能与Amp50效果相当；在铜绿假单胞菌(铜绿)和金黄色葡萄球菌(金葡)的抑制方面，发酵浆抑菌性能略低于Amp50；但在大肠杆菌(大肠)的抑制方面，发酵浆的抑菌性能介于Amp50与Amp100之间。这种显著提高的抑菌效果有助于绿色健康产品的开发与应用。

图4 发酵桑葚前后抑菌性能的变化Fig.4 Change of antibacterial properties in fermentationof mulberry(注：图中不同字母标注代表存在显著性差异，相同字母代表无显著性差异)

3 结论

本文以桑葚浆为原料通过乳酸菌发酵，测定了桑葚浆发酵过程中的理化指标，分析了发酵前后桑葚浆的品质变化。结果显示，桑葚经乳酸菌发酵后，保健功效得以显著提高：经NCU137发酵后，活菌数增至1.08×1010CFU/mL，有助于桑葚活菌饮料的开发；发酵后桑葚中主要有机酸由8.38 g/L增至23.55 g/L，赋予了开发绿色健康饮料方面对酸的需求，有助于拓宽桑葚产品种类；乳酸菌发酵改变了桑葚香气的种类，保持了它的主体香且增加了香气种类，使果浆更醇香；与鲜果对比，发酵浆抑菌性能显著增强，大大提高了产品的贮藏稳定性，符合大众对健康绿色食品的追求。总之，桑葚经乳酸菌发酵后，在品质与抑菌性方面均有显著性的改善，本研究为乳酸菌发酵桑葚制品及相关产品的开发提供一些参考与理论支持。但是本研究也有局限性，仅对部分指标分析讨论，后续可增加活性成分花青素、白藜芦醇、黄酮等方面的测定，以期更全面分析乳酸菌发酵对桑葚浆品质及抑菌性能的影响。