牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽低致敏性和抗过敏活性研究

方磊，李国明，徐珊珊，王憬，马勇，蔡木易，谷瑞增，鲁军

(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京，100015)

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质。正常情况下，人体免疫系统会对异己抗原排异，抗感染，消除衰老、损伤的细胞；当免疫系统失调时，就会出现反应低下，有时甚至反应过激，引起变态反应，造成机体对自身的伤害[1]，这种变态反应就是过敏，主要由IgE介导[2]，其临床症状主要有：腹泻、荨麻疹、发热、呕吐等等，严重情况下还可能造成虚脱和休克，甚至会危害生命，威胁着易过敏人群的身体健康[3-4]。根据国外流行病学的调查资料显示：全球大约有6%的儿童和3%～4%的成年人会对一种或者几种食物过敏，且发病率和死亡率呈逐年上升趋势[5]，因此国内外都在致力开发低过敏性或者具有抗过敏性的食品、保健食品和医疗药品。

1999年国际食品法典委员会第23次会议上，公布了八大类主要过敏食物，分别为鱼类、甲壳类、奶类、蛋类、花生、大豆、小麦、坚果类，并认为 90%以上的食物过敏反应均是由以上八大类食物引起的，其中水产品就占2类，当这些食物中的过敏蛋白与体内的IgE相互结合后就会触发过敏反应，因此，研究食物过敏的机理，通过部分或全部消除过敏原而降低食物过敏的发生率具有重要的社会意义。常见食物过敏原脱敏方法主要有加热、酶解、辐射等。热处理可以使过敏原的蛋白结构发生变化，使其空间抗原表位发生改变或者破坏，从而在一定程度上降低或祛除致敏性。史晓霞等[6]研究发现经不同温度热处理后的卵类粘蛋白二级结构的α-螺旋，β-折叠、β-转角以及无规卷曲之间相互转化导致其过敏原性变化；酶解会使蛋白质的肽链发生断裂，生成分子质量更小的多肽或游离氨基酸，破坏过敏原表位原有的空间结构，从而降低其过敏性。王丽娟等[7]利用木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉及虾蛋白，发现酶解产物致敏性明显降低，但未能完全消除。食源性低聚肽是以动植物食物蛋白为材料，经过酶解、分离纯化、喷雾干燥得到的低聚肽混合物。低聚肽的分子质量大部分在1 000 u以下，远远小于蛋白质的分子质量，主要以二肽或三肽为主，比游离的氨基酸更容易被人体吸收，具有促消化吸收、降胆固醇、抗氧化等一系列的营养价值与生理功能[8]。近几年研究发现，一些小分子质量的低聚肽对透明质酸酶的活性具有一定的抑制作用，从而起到抗过敏的作用，可以改善易过敏人群的饮食条件[9]。牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽都是通过酶解蛋白制成的小分子质量低聚肽，但是关于二者致敏性和抗过敏性的研究报道却很少见，故本文采用酶联免疫吸附法(ELISA)和透明质酸酶抑制法检测牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的致敏性和抗过敏性，为低致敏和抗过敏食品和药品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡蛎肽、三文鱼皮胶原肽、玉米肽、小麦肽分别来源于牡蛎肉、三文鱼皮、玉米蛋白和小麦蛋白，中食海氏生物科技有限公司；牡蛎肽-1、牡蛎肽-2、三文鱼皮胶原肽-1、三文鱼皮胶原肽-2四种寡肽，吉尔生化(上海有限公司)；2个牡蛎过敏血清编号1-2、2个三文鱼过敏血清编号3-4和2个阴性血清，Plasmalab公司；透明质酸酶、透明质酸钠，SIGMA公司；对-二甲氨基苯甲醛(P-DAB)，南京化学试剂股份有限公司；其余药品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DU-20恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；L-8900日立全自动氨基酸分析仪，天美(中国)科学仪器有限公司；酶标仪，Dynex Spectra Mr；Vivaflow 50超滤器，赛多利斯公司；LC-20AD型高效液相色谱仪，日本岛津公司；色谱柱，TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，日本TOSOH公司。

1.3 试验方法

1.3.1低聚肽的纯化

分别称取10 g牡蛎肽、三文鱼皮胶原肽溶解于100 mL蒸馏水中，用Vivaflow超滤器超滤去除低聚肽中的大分子组分，并将剩余组分冷冻干燥保存。

1.3.2低聚肽的氨基酸组成测定

参考GB/T 5009.124—2003[10]方法，采用L-8900日立全自动氨基酸分析仪进行测定。

1.3.3分子质量分布的测定

采用高效凝胶过滤色谱法测定分子质量的分布：按照林峰等[11]选取的色谱条件制作相对分子质量校正曲线，然后将牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽用流动相配成1 mg/mL的溶液，经聚四氟乙烯过滤膜(孔径0.2 μm)过滤后，上样进行高效凝胶过滤，使用GPC软件对色谱图进行分析。

1.3.4低聚肽的抗过敏活性检测

0.25 mmol/L CaCl20.1 mL加入0.5 mL透明质酸酶溶液(50 mg透明质酸酶溶于20 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液中，pH 4.01)37 ℃培养20 min；分别加入4种食源性低聚肽不同浓度的溶液，各加入0.5 mL，37 ℃保温20 min；然后在加入0.6 mL透明质酸钠(0.6 mg/mL)37 ℃保温20 min；加入0.4 mol/L NaOH 1 mL,迅速置于冰上冷却15 min；加入0.2 mL硼酸，沸水水浴3 min，立即冰水冷却5 min，加入P-DAB试剂3 mL，37 ℃保温20 min，显色，在585 nm下测定OD值[12]。

抗过敏活性计算：

(1)

式中：A,对照溶液(酶+缓冲液+底物)的OD值;B,对照空白(缓冲液+缓冲液+底物)的OD值;C,样品(酶+样+底物)的OD值;D,样品空白对照(缓冲液+样+底物)的OD值。

1.3.5低聚肽的致敏性检测：

按照ABRAMOVITCH等的方法[13]进行适当的调整，取96孔酶标板，将低聚肽溶液用CBS包被液稀释至5 μg/mL，每孔加100 μL至酶标板中，4 ℃包被过夜，用300 μL PBS-T(含有0.05%的Tween 20)缓冲液洗涤5次，以下所有的洗涤方式都以相同的方式进行；将抗原包被的96孔板在37℃下用300 μL PBS-T稀释的5%脱脂奶粉封闭1 h，并洗涤；向该板中加入100 μL用1%脱脂奶粉稀释的血清，然后在室温下摇动(45 r/min)孵育3 h，然后洗涤；再向每孔中加入100 μL二抗，将平板在室温下轻轻晃动孵育1h，将平板用PBST洗涤5次，然后再用PBS洗涤3次；再向每孔中加入200 μL的TMB显色液，室温避光孵育30 min，然后加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应，随后在酶标仪上450 nm处读出吸光值，所有ELISA重复3次。

1.3.6寡肽的抗过敏活性检测

按照2.4的方法，对4个不同寡肽的抗过敏活性进行测定。

1.3.7寡肽的致敏性检测

按照2.5的方法，对4个不同寡肽的致敏性进行测定。

1.3.8统计学处理

实验均重复3次，采用Origin 8.0软件对试验数据进行统计学处理，采用单因素方差分析，若t检验，p<0.05，则证明数据差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 低聚肽的氨基酸组成

牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的氨基酸组成和含量如表1所示，牡蛎肽中天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量较高，总含量为58.07%(质量分数)；富含人体必需的7种氨基酸(不含色氨酸)和2种半必需氨基酸(组氨酸和精氨酸)，含量分别为33.20%和8.92%(质量分数)，两者占氨基酸总和的42.12%(质量分数)；三文鱼皮胶原肽中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量较高，总含量为65.18%(质量分数)；富含人体必需的7种氨基酸(不含色氨酸)和两种半必需氨基酸，含量分别为22.48%和10.82%(质量分数)，两者占氨基酸总和的33.30%(质量分数)；从整体氨基酸组成来看：牡蛎肽中含有较多的疏水性、酸性和碱性氨基酸，而三文鱼皮胶原肽中亲水性氨基酸较多；以上表明：2种食源性低聚肽含有多种氨基酸且含量丰富，具有很高的营养价值，是人体补充必需氨基酸的重要来源。

表1 牡蛎肽、三文鱼皮胶原肽的氨基酸含量Table 1 The amino acid content of oyster peptides and Salmon skin collagen peptide

2.2 低聚肽的分子质量分布

牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的分子质量分布范围通过高效凝胶过滤色谱法测定：2种低聚肽的凝胶色谱图如图1所示，用GPC分析软件计算得到牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的分子质量分布范围，结果如表2所示；牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的分子质量主要分布在1 000 u以下，其中牡蛎肽含量为88.54%、三文鱼皮胶原肽含量为88.53%，分子质量在10 000 u以上的蛋白含量很低，其中三文鱼皮胶原肽的分子质量在10 000 u以上的含量为零，有研究报道[14]：分子质量较高的蛋白如人血清白蛋白或球蛋白、转铁蛋白等大分子蛋白可以增强透明质酸酶的活性。

图1 牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽色谱图(220nm)Fig.1 Oyster peptide and Sphinx skin peptide chromatogram (220nm)

由表2可以看出2种食源性低聚肽的分子质量在140～500 u范围内的肽段含量最高，分别占比52.74%和50.71%，占据了1 000 u以下分子质量的大部分，而分子质量在该范围内主要是二肽和三肽。从蛋白质和肽的吸收角度讲，人体从胃肠部位吸收二肽或三肽是一种重要的生理现象，且多数氨基酸是以寡肽形式被吸收的[15]。MAEBUCHI等[16]研究表明：蛋白质经酶解后形成的二肽和三肽可以不经消化，能够迅速被吸收，比游离氨基酸的吸收率提高2～2.5倍，具有更高的营养价值和生理功能[17]。

表2 低聚肽的分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of oligopeptides

2.3 低聚肽的抗过敏活性

低聚肽的抗过敏活性通过透明质酸酶抑制法来测定，并以2种植物食源性低聚肽(小麦肽和玉米肽)做对照，比较不同低聚肽的抗过敏活性。由图2可知，4种低聚肽的抗过敏活性高低顺序为：牡蛎肽>胶原肽>小麦肽>玉米肽，牡蛎肽的抗过敏活性最高，牡蛎肽的质量浓度为60 mg/mL时可以抑制50%以上的透明质酸酶的活性，相同质量浓度的胶原肽和小麦肽分别可以抑制35%和33%以上的透明质酸酶活性，玉米肽的抗过敏活性最低。

图2 食源性低聚肽对透明质酸酶抑制作用Fig.2 Food-borne oligopeptide on hyaluronidase inhibition

桂枝提取物可以有效抑制透明质酸酶活性[18]，且抗过敏活性和抗氧化活性有很好的正相关性，牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽具有较强的抗氧化作用[19-20]，0.529 mg/mL的牡蛎肽以及14.95 mg/mL的三文鱼皮胶原肽就可以抑制50%的羟基自由基，故2种低聚肽的抗过敏活性较高。抗过敏活性与低聚肽的分子质量大小呈负相关，分子质量小于1 000 u的肽段对透明质酸酶的抑制作用最大，抗过敏活性最强[9]。牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的分子质量分布试验表明，分子质量小于1 000 u的肽段含量高达88.5%以上，能够最大程度的抑制透明质酸梅的活性，从而起到抗过敏的作用。

2.4 低聚肽抗过敏活性剂量效应曲线

由图3可以看出，4种低聚肽的抗过敏活性均呈现一定的量效关系，在试验浓度范围内，抗过敏活性随着浓度的增加而提高。其中，牡蛎肽的抗过敏活性最强，玉米肽的抗过敏活性最弱。经过计算，牡蛎肽、三文鱼皮胶原肽、小麦肽和玉米肽的IC50值分别是51.57、79.37、89.57和107.01 mg/mL。

图3 低聚肽对透明质酸酶抑制作用的剂量-效应关系Fig.3 The dose-effect relationship of oligopeptide on hyaluronidase inhibition

虽然目前市场上有关抗过敏的药物很多，主要分为化学药物以及天然药物，尤以化学药物居多，但是化学药物的作用很强，一般会引起副作用，会损害人体的健康。天然药物是直接从天然植物中提取分离获得的，抗过敏效果明显，相对于化学药物对人体的影响较小，但是由于天然药物的成分比较复杂，目前的分离分析水平又不能完全分离这些复杂的化合物，给天然药物的分离制备带来很大的困难。与这些抗过敏药物相比，牡蛎肽和胶原肽的抗过敏活性要低很多，但是这2种低聚肽是来自食物蛋白质，成分明确，制备工艺比较成熟，具有较高的安全性，并且作用温和，不会产生咳嗽 、皮疹、肾脏毒害，味觉失调等毒副作用，可长期食用[21]。

2.5 低聚肽的低致敏性分析

采用ELISA法分析低聚肽的低致敏性，结果如图4和图5所示。

图4 牡蛎肽对血清IgE反应性Fig.4 Oyster peptide on serum IgE reactivity注：虚线代表阴性血清的平均OD值(牡蛎蛋白0.445，牡蛎肽0.323),与牡蛎蛋白相比，*表示p<0.05差异显著。

图5 三文鱼皮胶原肽对血清IgE反应性Fig.5 Trichosanthin collagen peptide on serum IgE reactivity注：虚线代表阴性血清的平均OD值(三文鱼蛋白0.315，三文鱼皮胶原肽0.181)，与三文鱼皮蛋白相比，*表示p<0.05差异显著。

牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽比相应的蛋白质具有较低的IgE反应性。与牡蛎蛋白相比，牡蛎肽对每种血清的IgE反应性显著降低(p<0.05)，且与血清2反应的OD450值要低于阴性血清的OD450值，几乎没有致敏性；三文鱼皮胶原肽对每种血清的OD450值均高于阴性血清的OD450值，具有致敏作用，但是与三文鱼蛋白相比其IgE反应性也显著降低(p<0.05)，由于蛋白质结构发生变化，所以2种低聚肽的致敏作用很低。

致敏性的强弱与过敏原蛋白的氨基酸数目、组成、排列顺序以及蛋白的分子构型有关，酶解可使蛋白质的肽链发生断裂，破坏过敏原蛋白原有的空间结构，从而降低其过敏性。蔡木易等[22]发明了一种酶解制备低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽的方法，经间接竞争ELISA法测定致敏性发现，牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低了80%以上。SHIMALURA等[23]采用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶P对甲壳动物蛋白进行酶解，发现经过酶解后蛋白质的过敏性几乎完全消失。牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽都是经过酶解蛋白制成的小分子多肽，可能破坏过敏蛋白原有的空间结构，故2种动物源性低聚肽的致敏性较低，是开发低致敏性功能食品的重要来源，可以作为新的功能营养成分应用于食品，保健食品和药品的开发与生产。

2.6 寡肽的序列及纯度分析

寡肽的合成由吉尔生化(上海)有限公司完成，序列见表3；并利用高效液相色谱(HPLC)对合成的寡肽纯度进行分析，以牡蛎肽-1为例，结果见图6，由图6中可以看出，合成的牡蛎肽-1纯度达到99.12%，牡蛎肽-2、三文鱼皮胶原肽-1、三文鱼皮胶原肽-2的寡肽纯度分别为98.13%、98.68%和98.52%。

表3 寡肽的序列及纯度Table 3 Sequence and purity of the oligopeptides

图6 牡蛎肽-1寡肽的HPLC分析Fig.6 HPLC result of Oyster peptide-1

2.7 寡肽的抗过敏活性

4种寡肽的抗过敏活性结果见图7，从图7中可以看出，4种寡肽的抗过敏活性高低顺序为：牡蛎肽-1>三文鱼皮胶原肽-1>牡蛎肽-2>三文鱼皮胶原肽-2；4种寡肽的分子质量大小在表3中可知，牡蛎肽-1<三文鱼皮胶原肽-1<牡蛎肽-2<三文鱼皮胶原肽-2，但4种寡肽的抗过敏活性依次降低，故抗过敏活性与低聚肽的分子质量大小呈负相关；从氨基酸的组成可知，牡蛎肽-1、三文鱼皮胶原肽-1、三文鱼皮胶原肽-2中含有缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸，均为疏水性氨基酸占比较高，说明寡肽的抗过敏活性与疏水性氨基酸有一定的正相关性；整体来看，牡蛎寡肽的抗过敏活性高于三文鱼皮胶原寡肽，与上述3.3中的牡蛎肽抗过敏活性高于胶原肽抗过敏活性的结果一致。MARIA等[24]合成了一种三肽RTY并发现该三肽可有效地抑制肥大细胞脱颗粒及大鼠嗜碱性粒细胞β-己糖胺酶的释放，降低过敏反应，表明食源性寡肽确实具有一定的抗过敏活性。

图7 不同寡肽的透明质酸酶抑制作用Fig.7 Different oligopeptides on hyaluronidase inhibition注：与牡蛎肽-1相比，*表示p<0.05，差异显著。

22.8 寡肽的低致敏性分析

牡蛎寡肽和三文鱼皮胶原寡肽的低致敏性结果如图8、图9所示，与相应的蛋白质相比，4种寡肽的OD450值均显著降低(p<0.05)；其中牡蛎肽-2对每种血清的OD450值均大于牡蛎肽-1，这是因为牡蛎肽-2中含有较多的亲水性氨基酸，而牡蛎肽-1中疏水性氨基酸较多，有文献报道[25-26]，食物过敏蛋白的氨基酸序列大多为亲水性氨基酸，与血清中的IgE容易结合从而导致过敏反应的发生；因此牡蛎肽-2的致敏作用要高于牡蛎肽-1；三文鱼皮胶原肽-1的OD450值小于三文鱼皮胶原肽-2，且2种寡肽的氨基酸序列中均以疏水性氨基酸较多，但二者的分子质量差异比较大，导致致敏作用不同；故食源性寡肽的致敏作用与氨基酸的组成和分子质量有一定的相关性。

图8 牡蛎寡肽对血清IgE反应性Fig.8 Oyster oligopeptides on serum IgE reactivity注：虚线代表阴性血清的平均OD值(牡蛎蛋白0.445, 牡蛎肽-1 0.472, 牡蛎肽-2 0.515)与牡蛎蛋白相比，*表示p<0.05，差异显著。

图9 牡蛎寡肽对血清IgE反应性Fig.9 Trichosanthin collagen oligopeptides on serum IgE reactivity注：虚线代表阴性血清的平均OD值(三文鱼蛋白0.315, 三文鱼皮胶原肽-1 0.175, 三文鱼皮胶原肽-2 0.206)，与三文鱼皮蛋白相比，*表示p<0.05，差异显著。

3 结论

本研究对牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的氨基酸组成和分子质量分布测定的基础上，对其抗过敏活性和致敏作用也进行了研究。牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的氨基酸组成丰富，富含人体必需氨基酸和半必需氨基酸(组氨酸和精氨酸)；2种低聚肽的分子质量小于1 000 u的肽段含量高达88.5%以上，主要分布在140～500 u范围内，以二肽和三肽为主；牡蛎肽、三文鱼皮胶原肽与小麦肽、玉米肽4种低聚肽对透明质酸酶都有一定的抑制作用，IC50值分别为51.57、79.37、89.57、107.01 mg/mL，其中牡蛎肽的抗过敏作用最强，胶原肽次之，玉米肽的抗过敏作用最弱；与相应的蛋白质相比，牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的致敏作用均显著降低。然后选择4种氨基酸组成和分子质量差异比较大的寡肽进一步研究其抗过敏活性和低致敏作用，发现牡蛎寡肽的抗过敏活性要高于三文鱼皮胶原寡肽，且寡肽的抗过敏活性与分子质量呈负相关性，与疏水性氨基酸呈一定的正相关性，4种寡肽的致敏作用也显著降低，且与氨基酸的组成和分子量有一定的相关性。目前，牡蛎肽和三文鱼皮胶原肽的生产技术已经基本成熟，且成分比较明确，对人体具有较高的安全性，为其作为低致敏和抗过敏成分应用于食品、药品的开发提供了一定的理论支持，但对于2种低聚肽的体内抗过敏活性及作用机制尚需进一步探讨。