大米辅料啤酒中蛋白质疏水性与蛋白质泡沫稳定性的分析

曹荣锟，李佳泰，王金晶，郑飞云，钮成拓，刘春凤，李永仙，李崎

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

啤酒主要是由麦芽、啤酒花、酵母和水为原料[1]酿造而成。在现代啤酒工业中，为了降低生产成本，在实际生产中通常会添加一定比例的辅料来代替部分麦芽。辅料的种类多样，有大米、玉米、淀粉、糖浆等，亚洲的啤酒酿造行业经常以大米作为辅料。大米富含营养物质，淀粉含量高达75%～82%，无水浸出率高(90%～93%)，脂肪含量低，基本不含多酚物质，且含有较多的泡沫蛋白，是优良的啤酒辅料。周林生[2]研究表明蛋白质含量较高的大米对啤酒泡沫有重要的贡献作用，大米中富含糖蛋白，导致了麦汁中泡沫蛋白质浓度较高，并保留到最终成品啤酒中，使成品啤酒具有较好的泡持性，证明了大米辅料的添加对啤酒泡沫稳定性有一定的影响。SHOKRIBOUSJEIN[3]研究表明啤酒蛋白质会很大程度地影响啤酒泡沫的质量。

蛋白质泡沫稳定性和啤酒泡沫稳定性不是一个概念，但又有很大的关联。蛋白质泡沫稳定性是指蛋白质溶液在机械剪应力的作用下可以快速分散在气液两相中形成的蛋白质膜的稳定性。陈熙等人的研究表明蛋白质含量与啤酒泡沫稳定性有很强的正相关性，蛋白质本身泡沫稳定性的增强会对啤酒泡沫稳定性的提高有重要意义[4-5]，研究蛋白质的泡沫稳定性可以对研究啤酒泡沫稳定性起到重要的预测作用。除了蛋白质泡沫稳定性外，蛋白质疏水性也与啤酒泡沫的稳定性有一定的联系。蛋白质较低的表面疏水性有利于啤酒泡沫的稳定[6-7]。因此探究添加大米辅料对蛋白质泡沫稳定性和疏水性的影响有重要意义。

本论文研究不同比例大米辅料啤酒的蛋白质泡沫性能，以及与蛋白质表面疏水性的关系，为大米辅料啤酒蛋白质的深入研究以及添加大米辅料对啤酒泡沫稳定性的影响提供理论依据，同时也有利于以后研究原料、辅料蛋白质的理化特性从而简单预测啤酒泡沫稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验试剂

耐高温淀粉酶、中性蛋白酶：购于诺维信(中国)投资有限公司；ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)：购于Sigma公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)试剂盒：购于碧云天生物技术公司；宽分子量蛋白质Marker：购于大连宝生物技术公司。

1.2 仪器与设备

生化培养箱BSP-250，上海博迅公司；BGY-8A型糖化仪，杭州博日科技有限公司；阿贝折光仪，泰光有限公司；DLEUW22050麦芽粉碎机，Buhler-Miag公司；低温水浴槽，上海博迅公司；Enspire2300型多标记检测系统(酶标仪)，美国Perkinelmer公司；L-8900型氨基酸分析仪，日本Hitachi株式会社；垂直板蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白质的提取

啤酒超声除气后，缓慢加入粉碎好的(NH4)2SO4粉末使溶液相对饱和度达到80%，室温下搅拌1 h后，4 ℃静置过夜，8 000 r/min离心10 min，小心取出沉淀，加入适量去离子水溶解沉淀后，8 000 r/min离心10 min，取上清液置于透析袋中透析过夜，滴加BaCl2溶液检验透析效果，收集最终的啤酒蛋白溶液。

1.3.2 蛋白质表面疏水性的测定

ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)荧光探针法是一种应用较为普遍的蛋白质疏水性检测方法，其原理是由于染色剂(即荧光探针分子)在激发态具有更强的偶极矩[8]，当荧光探针分子ANS与疏水基团结合之后，发出的荧光强度会有所提高，通过数据的量化可以计算出蛋白质的表面疏水值。采用ANS荧光探针法[9]测定啤酒蛋白质表面疏水性，将啤酒蛋白质用0.01 mol/L PBS (pH 7.0)的磷酸缓冲液稀释至蛋白浓度为25、50、75、100、125、150 μg/mL 6个不同的梯度，再用缓冲液配制8 mmol/L的ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)溶液。取4 mL不同蛋白质浓度样品加入20 μL ANS溶液，振荡混匀后，室温下避光反应3 min。设定酶标仪激发波长λex=390 nm，λem=470 nm后检测样品的荧光强度。以蛋白浓度为横坐标,样品的荧光强度为纵坐标作图，表面疏水性指数即为图中的线性回归斜率。

1.3.3 蛋白质理论疏水性的测定

通过不同的氨基酸理论疏水性指数来计算蛋白质理论疏水性的大小，常用的5种指数量表分别为Eisenberg量表、Kyte量表、Meek量表、Roseman量表、Miyawaza量表[10-11]。测定啤酒蛋白质水解后氨基酸的相对含量，结合氨基酸理论疏水指数计算啤酒蛋白质的理论疏水值。向蛋白质样品中加入6 mol/L的浓盐酸水解过夜，0.45 μm滤膜过滤除去碳化颗粒后得到水解氨基酸溶液，调节pH值为4.0，使用氨基酸分析仪测定水解后氨基酸的相对含量。

1.3.4 蛋白质泡沫稳定性的测定

蛋白质泡沫稳定性是指蛋白质溶液在机械剪应力的作用下可以快速分散在气液两相中形成的蛋白质膜的稳定性[12]。取40 mL蛋白质浓度为0.4 mg/mL的样品置于250 mL的量筒中，在室温下用高速分散均质机均质60 s，转速为7 000 r/min。产生大量泡沫后，室温静置30 min读取泡沫衰减后的体积v。对蛋白质泡沫稳定性进行计算[13]：

(1)

式中：FS，蛋白质泡沫稳定性，%；V，30 min读取泡沫衰减后的体积，mL。

1.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳

使用碧云天SDS-PAGE试剂盒进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验，所用蛋白胶为12%分离胶和5%浓缩胶。将啤酒蛋白质样品和Marker与上样缓冲液1∶1混合后沸水浴5 min使其变性。Marker与样品的上样量均为10 μL。采用考马斯亮蓝R-250染色法进行染色。将凝胶小心浸没于染色液中，置于震荡仪上轻微振荡1～2 h。然后再使用含体积分数分别为8%乙酸、23.75%乙醇的脱色液反复脱色2 h左右至背景无色且条带清晰。

1.3.6 不同比例大米辅料啤酒的制备

麦汁的制备: 大米细粉在糊化温度到达55 ℃进行投料，料水比为1∶5(g∶mL)，辅料比分别为10%、20%、30%。添加适量耐高温α-淀粉酶保温10 min，升温至75 ℃保温10 min，再升温到95 ℃保温30 min糊化结束。糖化过程同时进行，48 ℃开始投入麦芽保温30 min，升温到63 ℃并醪。63 ℃保温60 min后升温到72 ℃保温20 min，最后升温到78 ℃，过滤得到麦汁。

1.3.7 纯大米啤酒的制备

大米糖化液的制备：大米细粉和水以1∶5(g∶mL)混合，55 ℃投料。添加适量耐高温α-淀粉酶保温10 min，升温至75 ℃保温10 min，再升温到95 ℃保温30 min。糊化液降温至63 ℃，加入适量β-淀粉酶和中性蛋白酶，保温并搅拌60 min。再升温到72 ℃，保温并搅拌20 min。最后升温到78 ℃，过滤得到糖化液。

纯大米啤酒发酵：纯大米啤酒发酵与大米辅料啤酒发酵方法相同，见1.3.6。

2 结果与分析

2.1 大米辅料添加比例对蛋白质泡沫稳定性的影响

蛋白质溶液的泡沫与啤酒泡沫除了起泡方式不同(一个是机械剪应力作用产生泡沫[14]，一个是通过CO2的释放产生泡沫)之外，主要组分(蛋白质、水)有很大的相似性。因此研究蛋白质泡沫的稳定性对研究大米啤酒泡沫稳定性有一定的理论意义。添加不同比例大米辅料代替相应比例麦芽进行啤酒发酵实验。测量发酵结束后啤酒蛋白质的泡沫稳定性，结果见图1所示。

1-纯麦芽啤酒蛋白; 2-10%大米辅料啤酒蛋白;3-20%大米辅料啤酒蛋白;4-30%大米辅料啤酒蛋白图1 不同大米添加比例啤酒蛋白质泡沫稳定性的变化Fig.1 The foaming stability of different beer protein adding different proportions of rice

如图1所示，随着大米辅料添加比例的增加，大米辅料啤酒蛋白质的泡沫稳定性也逐渐提高，由62.14%提升到68.25%。添加10%、20%大米辅料，啤酒蛋白质泡沫稳定性提升较小，可能是大米辅料添加量较少，导致最终来源于大米的蛋白质含量较小，对啤酒蛋白质整体的泡沫稳定性不能产生较大的影响。综上所述，当添加大米辅料添加量增加到30%左右时，蛋白质泡沫稳定性会得到明显提升。

2.2 大米辅料啤酒蛋白理化特性分析

2.2.1 表面疏水性的研究

表面疏水性能够比较直观地反映蛋白质表面疏水性基团在极性溶液环境中数量的多寡，从而反映蛋白质结构的变化，与蛋白质的泡沫稳定性、起泡性有一定的相关性[15-16]。图2为添加不同比例大米辅料的啤酒蛋白质以及全麦芽啤酒蛋白质的表面疏水性的变化。

1-全麦芽啤酒蛋白; 2-10%大米辅料啤酒蛋白;3-20%大米辅料啤酒蛋白; 4-30%大米辅料啤酒蛋白图2 大米添加比例对啤酒蛋白表面疏水性的影响Fig.2 The surface hydrophobicity of different beer protein adding different proportions of rice

由图2可以看出，大米辅料添加比例从10%逐渐增加到30%，其啤酒蛋白质疏水性指数由118.86减少到103.87。推测在蛋白质表面的非极性氨基酸残基暴露减少，形成疏水区域也逐渐减少，使蛋白质对水的亲和能力增强，导致其泡沫稳定性的增强。综上所述，随着大米辅料添加比例的增加，啤酒蛋白质的表面疏水性明显下降。

2.2.2 理论疏水性的研究

为了验证啤酒蛋白质的表面疏水性的改变是否很大程度来源于氨基酸组成的变化，测定啤酒蛋白质水解后各种氨基酸的相对含量，通过5种不同量表计算得到4种大米辅料啤酒蛋白质的理论疏水性，结果如图3所示。

图3 大米添加比例对蛋白理论疏水性的影响Fig.3 The oretical hydrophobicity of different beer protein adding different proportions of rice

如图3可知，啤酒蛋白质的理论疏水值变化趋势与啤酒蛋白质的表面疏水性有相似的变化趋势。随着大米辅料添加比例的增加，大米辅料啤酒蛋白的理论疏水性逐渐减少。由此说明在啤酒酿造过程中，添加了不同比例大米辅料的啤酒在酿造过程中氨基酸的组成和含量发生了一定程度的变化，不同氨基酸序列编码的蛋白质因空间构型的不同会对蛋白质的表面疏水性产生影响。与表面疏水指数相比，理论疏水指数在大米辅料添加量为30%时下降更为明显。造成这种差异的主要原因可能是，在麦汁糖化过程以及啤酒发酵过程中发生的一些美拉德反应，使一些糖链结合在蛋白质的氨基酸残基上。综上，大米辅料啤酒蛋白质表面疏水性的改变很大程度来源于蛋白质氨基酸组成的变化。

2.3 纯大米啤酒发酵试验

2.3.1 纯大米啤酒蛋白表面疏水性

为了进一步验证啤酒中来源于大米的蛋白质是否会对啤酒蛋白质的表面疏水性造成影响。本研究仅仅使用大米为原料(排除了麦芽蛋白质的影响)进行啤酒发酵，提取全大米啤酒蛋白，不同蛋白质的表面疏水性见图4。

1-全麦芽啤酒蛋白; 2-10%大米辅料啤酒蛋白;3-20%大米辅料啤酒蛋白; 4-30%大米辅料啤酒蛋白;5-纯大米啤酒蛋白质图4 全麦芽啤酒蛋白质、大米辅料啤酒蛋白质和纯大米啤酒蛋白质表面疏水性的比较Fig.4 The surface hydrophobicity of whole malt beer protein, rice beer protein and all rice beer protein

由图4可知，通过ANS荧光探针法测得纯大米啤酒蛋白质的表面疏水指数仅为42.25，相较于全麦芽啤酒蛋白的表面疏水性有大幅度的下降，下降了约64%，证明了啤酒中来源于大米的蛋白质本身表面疏水性相对较低，导致添加大米辅料，整体啤酒蛋白的疏水性有所下降。而大米辅料啤酒蛋白的表面疏水性随着辅料添加比例增加到30%，表面疏水指数只下降了12.72%，并没有较大幅度的减少。主要原因是啤酒中蛋白质主要来源于原料中的水溶性蛋白质，50%左右为大麦乳清蛋白[17]。而大米蛋白质主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白等4种蛋白质组成。其中80%左右为谷蛋白，易溶于稀碱、稀酸[18]，水溶性蛋白含量相对较少，所以在酿造过程中不能完全溶解。由此可知，大米辅料的添加比例增加到一定程度时，蛋白质表面疏水性才会较明显地降低，这是由大米蛋白质本身较低的疏水性导致的。

2.3.2 凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

采用外加酶法使用大米制备纯大米啤酒。提取纯大米啤酒蛋白质和全麦芽啤酒蛋白质，对样品进行SDS-PAGE分析如图5所示，发现纯大米发酵液蛋白在14.3 kDa左右有一个颜色较深的蛋白条带，经过质谱分析，该条带蛋白质为来源于大米的RAG2蛋白，是一种α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制。由于纯大米啤酒蛋白质较低的表面疏水性，推测RAG2蛋白也是一种表面疏水性较弱的蛋白质，有利于啤酒泡沫的稳定性。韩宇鹏[6]等人的研究表明啤酒蛋白质中43 kDa左右主要为蛋白质Z，来源于大麦芽。而2号泳道在43 kDa左右无明显条带，推测在大米中含有蛋白质Z的可能性较小，大米辅料啤酒中蛋白质Z的含量也会随着大米辅料的增加而降低。陶林[19]等人的研究表明，啤酒中主要的强疏水蛋白为蛋白质Z，而大米辅料啤酒中蛋白质Z的相对含量较低，导致了大米辅料啤酒蛋白质疏水性较低。

M-蛋白质Marker；1-全麦芽啤酒蛋白；2-纯大米啤酒蛋白图5 SDS-PAGE分析比较全麦芽啤酒蛋白质和纯大米啤酒蛋白质Fig.5 SDS-PAGE of whole malt beer protein and all rice beer protein

3 结论

本文研究了添加大米辅料对啤酒蛋白质疏水性和泡沫稳定性的影响，结果表明随着大米辅料添加比例逐渐增加，啤酒蛋白的表面疏水性出现显著的下降趋势，而蛋白质泡沫稳定性逐渐提高。蛋白质表面疏水性下降是由于暴露在蛋白质外部的氨基酸残基的变化造成的，而大米辅料的添加影响了蛋白质氨基酸的组成，大米蛋白质本身较低的表面疏水性决定了大米啤酒蛋白质较低的表面疏水性。较低的表面疏水性也造成了大米啤酒蛋白质泡沫稳定性的提升，对啤酒泡沫的稳定性有一定影响。