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三株植物乳杆菌对代谢综合征大鼠肠道菌群的影响

2018-10-17朱广素王刚王园园马方励赵建新张灏陈卫

食品与发酵工业 2018年9期
关键词:高脂益生菌菌群

朱广素,王刚*,王园园,马方励,赵建新,张灏,陈卫

1(江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122) 2(无限极(中国)有限公司,广东 广州,510623)

代谢综合征作为流行性疾病在世界范围内爆发,主要症状包括高血糖、高血脂、高血压、胰岛素抵抗及肥胖等一系列代谢紊乱,而营养过剩是其主要发病原因之一[1-3]。近年来,大量研究表明,机体通过免疫-代谢-菌群之间的相互作用在高脂饮食引发的肥胖及代谢性疾病中发挥重要作用[4-6]。饮食、药物、抗生素和免疫系统紊乱等因素导致的肠道内有益菌减少同时可能导致炎症的病原菌增加[7-9],与代谢性疾病、心脑血管疾病及糖尿病等慢性病的发生发展密切相关[4, 10-11]。益生菌具有调节肠道菌群失调、增强肠道免疫、维持内环境稳态的作用,因此,通过膳食补充益生菌靶向调节肠道菌群结构将成为缓解代谢综合征的有效途径[12-13]。

近年来,逐渐成熟的高通量测序技术,因其测序通量及准确度较高,可对微生物群落中的物种组成及遗传信息进行相对定量分析[14-15],成为深入分析肠道菌群的结构和功能的重要工具[16-17]。本实验室前期对来自不同地区传统泡菜中的植物乳杆菌进行分离,通过体外筛选得到3株具有良好耐酸、耐胆盐特性的菌株。本研究建立了高糖高脂饮食诱导的代谢综合征大鼠模型,采用Miseq高通量测序技术,对益生菌干预后的大鼠肠道菌群的差异进行分析,评价不同菌株对代谢紊乱大鼠肠道菌群多样性和物种组成的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

主要试剂:MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司;高糖高脂饲料,北京华阜康生物技术有限公司;TaqDNA聚合酶,上海科晴生物科技有限公司;FastDNA Spin Kit for Soil细菌基因组提取试剂盒,MP bio;QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒,QIAGEN;Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,Life Technologies;KAPA Biosystems Library Quantification Kit,KAPA Biosystems;TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit,Illumina;Miseq Reagent Kit,Illumina。

主要实验设备:高速冷冻离心机,Eppendorf;大容量冷冻离心机,多功能酶标仪,Thermo;快速核酸提取仪FastPrep-24,MP;SpectraMax M5酶标仪,Molecular Devices;Agilent Bioanalyzer 2100,Agilent;Miseq测序仪,Illumina;CFX Connect Real-time System,Bio-Rad。

1.2 实验菌株

实验用菌株均来自于江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心(CCFM),鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusGG(LGG)为对照菌株。菌株具体信息及来源见表1。

表1 菌株信息表Table 1 Strains information

1.3 实验动物

实验动物为SD雄性大鼠,购于上海斯莱克公司。适应1周后,随机分为8组。饲养条件为:4只一笼,同室饲养,自由饮食饮水;温度为(22±2) ℃;湿度为(55±5)%;12 h光暗交替。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液的制备

将菌株接种于MRS培养基中,37 ℃活化2代后用于制备动物实验所需菌悬液。将培养好的菌液以8 000×g离心20 min,无菌PBS缓冲液清洗菌体2遍,调整活菌数为5×1010CFU/mL,用质量浓度为300 g/L的蔗糖溶液重悬后,于-80 ℃保藏备用。灌胃前用无菌水稀释10倍。

1.4.2 动物分组及处理条件

实验方案见表2。辛伐他汀和罗格列酮分别作为降血脂和降血糖的阳性对照。

表2 动物实验方案Table 2 Protocol of animal experiment

1.4.3 大鼠粪便收集及细菌DNA的提取

参考MAO等[18]的研究在第12周实验结束前,收集大鼠粪便,按照FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒的操作步骤提取大鼠粪便中细菌基因组。

1.4.4 细菌16S rDNA的扩增

以细菌基因组为模板,扩增16S rDNA的V3-V4区(上游引物341F: CCTAYGGGRBGCASCAG;下游引物806R: GGACTACNNGGGTATCTAAT;扩增片段长度465 bp),不同样品用7个碱基组成的barcode进行区分,加在上游引物341F的5’端。50 μL聚合酶链反应(PCR)反应体系及条件见表3。

表3 PCR反应体系及条件Table 3 Reaction system and conditions of PCR

PCR反应结束后,进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,电压 120 V,约 30 min,凝胶成像仪拍照并记录电泳结果。

1.4.5 扩增产物的纯化、定量及等质量混样

根据凝胶电泳结果,切胶,按照QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒的操作步骤进行PCR产物的回收;纯化的DNA样品按照Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂盒的操作步骤,测定浓度(ng/μL);根据定量结果,按照总体积为50 μL,等质量浓度混合样品。

1.4.6 文库构建及上机测序

按照TurSeq Nano DNA LT Sample Preparation Kit试剂盒的操作步骤构建文库,包括末端修复、纯化去片段、3’端加A、接头连接、PCR扩增及纯化;文库构建完成后,采用Agilent Bioanalyzer 2100测定DNA片段的大小;按照KAPA Biosystems Library Quantification Kit 试剂盒的操作步骤,qPCR法精确测定DNA的质量浓度(ng/μL);将构建的文库按照上机试剂盒的要求进行前处理,用MiSeq测序仪上机测序。

1.4.7 下机数据处理

测序完成后,参照毛丙永[19]的方法,对下机数据进行处理。在QIIME平台计算样品的α-多样性和β-多样性

1.5 数据统计分析

使用OriginPro 2017 和Graphpad Prism5进行绘图,使用SPSS 22.0对实验数据进行差异显著性分析。相同字母代表无显著性差异,p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 大鼠肠道菌群的多样性

2.1.1 α-多样性分析

通过Miseq高通量测序,59个粪便样品共产生1 561 896条高质量的16S rDNA序列,平均每个样品26 473条;所有序列按照参考序列聚类,按照97%序列相似性划分OTU,共产生498 218个OTU。

所有样品的Chao1指数、Shannon 指数的结果如图1所示。结果表明,NC对照组与HFHS模型组的α-多样性分析无显著差异。灌胃植物乳杆菌CCFM591显著提高了Chao1指数,与RH药物组和对照菌株LGG水平相当,与测序的OTU结果相吻合。RH药物组的Shannon指数最大,CCFM591和LGG组次之。

A-chaol指数;B-shannon指数图1 植物乳杆菌对代谢综合征大鼠α多样性指数的影响Fig.1 Effects of L. plantarum on α diversity index in rats with metabolic syndrome

2.1.2 β-多样性分析

基于UniFrac距离对样品进行非加权的主坐标分析结果如图2所示。从PCoA图可以看出,NC对照组聚集在右上方,与其他组别完全分开;SC和RH药物组、HFHS模型组与4株乳杆菌灌胃组分别聚集在左上、中和下方;表明不同的干预方式显著改变了大鼠肠道菌群的结构。

▶-NC;●-HFHS;◆-SC;-RH;◀-CCFM591;■-QS6-12;▲-ZS2058;▼-LGG;a-PCoA-PC1 vs PC2;b-PCoA-PC1 vs PC3图2 基于UniFrac距离对样品进行非加权的主坐标分析Fig.2 Principal coordinates ananlusis (PCoA) plots based on unweighted UniFrac metrics

PC1解释了总变异的4.38%,将NC组与其他7组高糖高脂饮食组完全分开,表明PC1反映的是饮食影响因素;PC2解释了总变异的3.23%,将药物组、模型组和乳杆菌干预组完全分开,表明PC2反映的不同干预方式发挥的作用;PC3解释了总变异的2.73%,乳杆菌干预组和NC组在PC3上比较接近,表明乳杆菌干预能使高糖高脂饮食导致的菌群紊乱趋于正常化;综合PC1和PC3的聚类结果表明,LGG和ZS2058组大鼠的菌群结构与正常组相似。

2.2 大鼠肠道菌群结构

2.2.1 益生菌对大鼠肠道菌群门水平相对丰度的影响

采用16S rDNA技术分析大鼠粪便的菌群组成,结果发现,在门水平(图3),大鼠肠道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria组成,其中丰度最大的是Firmicutes和Bacteroidetes,平均相对丰度分别为82.94%和9.99%。

图3 不同组别大鼠肠道菌群在门水平上的组成Fig.3 Composition of the gut microbiota in different groups of rats at the phylum level

与NC组相比,HFHS饮食使大鼠的肠道菌群发生了显著变化,即Firmicutes和Proteobacteria丰度增加、Bacteroidetes和Actinobacteria丰度降低(图4),而CCFM591和LGG灌胃后能使菌群恢复到正常水平;同时,CCFM591和LGG处理也使Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值显著降低(图5),与药物RH的效果相当。

2.2.2 益生菌对大鼠肠道菌群科水平相对丰度的影响

进一步分析大鼠粪便的菌群组成,结果发现,在科水平(图6),正常饮食的大鼠肠道菌群主要由Lactobacillaceae、S24-7、Ruminococcaceae、Clostridiaceae、Turicibacteraceae、 Corynebacteriaceae组成,而HFHS中,Lactobacillaceae、Lachnospiraceae和Clostridiales(未知科)的相对丰度显著增加;灌胃乳杆菌能调整肠道菌群的结构,同时使Bacteroidaceae丰度显著增加,其中LGG处理组菌群组成最接近NC组,CCFM591次之。

与NC组相比,HFHS饮食导致Lachnospiraceae相对丰度的增加,S24-7、Turicibacteraceae 、Clostridiaceae的相对丰度降低(图7)。CCFM591和QS6-12干预能够显著增加S24-7的相对丰度;ZS2058干预能够提高Turicibacteraceae和Clostridiaceae的相对丰度。4株益生菌灌胃均能显著降低Lachnospiraceae的相对丰度;各组别中Ruminococcaceae的相对丰度无统计学差异。

图4 不同组别大鼠菌群主要门的相对丰度的变化Fig.4 Relative abundance of dominant phylum in different groups

图5 不同组别大鼠菌群Firmicutes/Bacteroidetes(A)和Proteobacteria/Bacteroidetes(B)比值的变化Fig.5 Ratio of Firmicutes/Bacteroidetes (A) & Proteobacteria/Bacteroidetes (B) in different groups

图6 不同组别大鼠肠道菌群在科水平上的组成Fig.6 Composition of the gut microbiota in different groups of rats at the family level

2.2.3 益生菌对大鼠肠道菌群属水平相对丰度的影响

进一步分析了大鼠肠道菌群在属水平上的多样性(图8),共检测到260个属。分析发现,NC组大鼠菌群主要由Lactobacillus、Turicibacter、未分类S24-7 、Bifidobacterium、Corynebacterium、Prevotella、Enterococ-cus组成,而HFHS组大鼠主要由Lactobacillus、未分类Clostridiales、未分类Lachnospiraceae和未分类S24-7组成;SC和RH药物处理组Blautia相对丰度增加,乳杆菌干预使Bacteroides的丰度明显升高;在属水平上,LGG组的菌群组成最接近正常水平。

图7 不同组别大鼠菌群特定科的相对丰度的变化Fig.7 Relative abundance of selected family in different groups

图8 不同组别大鼠肠道菌群在属水平上的组成Fig.8 Composition of the gut microbiota in different groupsof rats at the genus level

所有大鼠样品属水平分析发现,Bacteroidetes包含24个属,Actinobacteria包含38个属,Proteobacteria包含67个属,而Firmicutes包含了113个属,是大鼠肠道中绝对的优势菌群,图9所示为隶属于Firmicutes门的特定属的相对丰度的变化。

与NC组相比,HFHS组使大鼠肠道中Turicibacter的含量下降,而Blautia、Coprococcus、Roseburia、[Ruminococcus]和Oscillospira的丰度显著升高。ZS2058组大鼠肠道中Turicibacter的丰度较高,Oscillospira的丰度较低,与正常组接近;Dorea在RH和SC药物组大鼠肠道中的相对含量明显高于其他组别,且具有统计学差异;Streptococcus在LGG组大鼠中的含量略高于其他组别,HFHS中丰度最低。益生菌干预显著提高了大鼠肠道中Lactabacillus的相对丰度,同时降低了大鼠肠道中Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相对丰度。

图9 不同组别大鼠Firmicutes主要属的相对丰度的变化Fig.9 Relative abundance of dominant genus in Firmicutes in different groups

3 讨论

营养吸收与消耗失衡会引发一系列的代谢紊乱,从而导致肠道菌群结构发生改变[20]。近年来,益生菌及益生元被作为膳食补充剂以缓解慢性炎症,但其在调节饮食诱导的肠道菌群改变中发挥的具体作用仍不明确。本研究通过建立高糖高脂饮食大鼠模型,采用Miseq高通量测序技术,深入分析了同种不同株的植物乳杆菌对肠道菌群多样性及其结构组成的影响。

通过对下机数据进行分析,发现每个样品的goods_coverage指数都接近于1,说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。Chao1指数和Shannon指数分别表示菌群丰度和多样性,与前人的研究一致[21-22],补充降糖药物RH、植物乳杆菌CCFM591和鼠李糖乳杆菌LGG可显著提高大鼠菌群的多样性。WEST等[23]研究表明,外源补充益生菌能增加干酪乳杆菌的含量,但并不能显著改变菌群结构。进一步的PCoA分析发现,高脂饮食使菌群结构发生显著改变,而益生菌干预对大鼠肠道菌群结果组成有一定的调节作用,但并不完全恢复至与正常大鼠一致。

高糖高脂饮食会导致肠道菌群失调,从而引发胰岛素抵抗、肥胖和其他代谢性疾病。大量研究表明益生菌干预可以调节Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值改变肠道菌群的结构[24-25]。WANG等[21]通过454焦磷酸测序的方法,发现益生菌干预增加了与代谢综合征呈正相关的OTU;BI等[20]通过IL-17A缺失小鼠模型发现,高脂饮食会使Firmicutes/Bacteroidetes的比值增加;LIM等[26]发现B.adolescentisIM38可以通过降低Proteobacteria/Bacteroidetes的比值抑制脂多糖的产生,从而缓解高脂饮食引发的结肠炎。在门水平上对物种组成进行分析,发现Firmicutes和Bacteroidetes是大鼠肠道中的优势菌群,HFHS饮食使Firmicutes丰度增加、Bacteroidetes丰度降低;CCFM591和LGG处理降低了Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值。

进一步在属水平上分析不同样品的物种组成,HFHS饮食大鼠在属水平上肠道菌群的组成差异较大。与前人的研究一致,Lactobacillus和Turicibacter(均属于Firmicutes)是正常大鼠肠道中的优势种属。Turicibacter能够产乳酸,是大鼠肠道中特有的丰度较高的种属。与Turicibacter相关的报道仍较少,分离自急性阑尾炎病人血细胞的Turicibactersanguinis是少有的被系统性研究的种属[27];PRESLEY等[28]通过研究小鼠菌群与免疫系统的关系,发现Turicibacter与免疫调节细胞具有潜在的联系。本文研究表明,补充植物乳杆菌ZS2058能够提高大鼠肠道中Turicibacter的含量。

Firmicutes不同种属含量的改变与特定的饮食相关,低碳水化合物的减肥饮食使产丙酸的Firmicutes(主要是Roseburia)丰度下降[29-30]。结果显示,高糖高脂饮食增加了大鼠肠道中Firmicutes的丰度,补充益生菌降低了大鼠肠道中Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相对丰度。然而大量研究表明益生菌可以通过产生短链脂肪酸缓解高脂饮食导致的代谢紊乱,因此还需在种水平上深入分析植物乳杆菌对高糖高脂大鼠肠道菌群的影响。

4 结论

采用高通量测序技术,对代谢综合征大鼠粪便样品进行宏基因组分析发现,植物乳杆菌 CCFM591的干预显著降低了Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值,并且提高了菌群丰度及多样性;PCoA结果表明,灌胃植物乳杆菌可一定程度的改善菌群结构,提高大鼠肠道中Lactabacillus的相对丰度,同时降低了Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相对丰度。

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