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16例中途胚胎植入前遗传学诊断/筛查病例报道及文献复习

2018-10-17柏海燕师娟子

生殖医学杂志 2018年10期
关键词:整倍体玻璃化囊胚

柏海燕,师娟子

(西北妇女儿童医院,西安 710003)

胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)是在体外受精胚胎移植(IVF-ET)过程中,对形态学可用的胚胎进一步进行种植前活检和遗传学分析,选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔,从而获得正常胎儿的诊断方法,其适应证包括染色体异常、单基因病、不明原因复发性自然流产、反复种植失败、高龄等。目前,许多生殖中心在实施IVF-ET时并未将染色体核型分析列为常规术前检测项目,有的不孕患者最初没有PGD/PGS指征,在接受常规IVF助孕后产生了新的诊断,又符合PGD/PGS指征,进而要求对剩余冻存的胚胎进行PGD/PGS。如果我们把从开始计划实施的PGD/PGS称为计划PGD/PGS,则可以把这种中途突发进行的PGD/PGS称为中途PGD/PGS(Midway PGD/PGS)。本文通过对1例Midway PGD/PGS过程详细报道,结合其他15例相似病例的治疗结局,复习文献,分析中途PGD/PGS与计划PGD/PGS操作的不同之处及对结局的可能影响,以期为今后临床实践提供参考。

一、病例报道

患者28岁女性,既往早孕人流1次,不孕2年,造影提示双侧输卵管阻塞,男方精液化验正常。于2017年1月来西北妇女儿童医院生殖中心接受IVF-ET治疗。采用经典长方案,黄体中期起予短效曲普瑞林(GnRH-a,达必佳,辉凌,德国)0.1 mg进行垂体降调节,达降调效果后每天加用基因重组人FSH(rFSH,果纳芬,默克雪兰诺,瑞士)150 U促排。当3个以上卵泡直径≥18 mm时,注射HCG(珠海丽珠)10 000 U诱导排卵,36 h后采卵,取卵当天起给予黄体酮60 mg/d肌肉注射。获卵18枚,常规IVF受精,2PN 14个,序贯培养至D5,共形成7个可用囊胚(依据Garnder囊胚分级法)。移植一枚囊胚(4BB)后剩余6枚囊胚行玻璃化冷冻。移植后继续黄体酮60 mg肌肉注射,12 d后测血清HCG 688 U/L,移植后28 d B超提示宫内单活胎,移植后52 d B超提示胚胎停育,行清宫术。术后3个月后再次解冻移植(FET)2枚囊胚(4BB、4BC),结局仍为单胎孕早期自然流产。2次流产物均未送遗传检测。

对夫妇双方进一步做复发性流产(RSA)相关检查,包括双方染色体核型分析、女方血浆D-2聚体、血同型半胱氨酸、血小板聚集度、抗凝血酶Ⅲ活性、抗心磷脂抗体、抗糖β2蛋白抗体、抗核抗体、抗dsDNA、淋巴细胞亚群、蛋白S、蛋白C。发现男方染色体核型为46,XY,t(5;13)(q22;q22),其他检测结果未见异常。该夫妇进行遗传咨询时被告知:男方为平衡的相互易位携带者,子代理论上有1/18几率染色体完全正常、1/18几率为相互平衡易位携带者,其余几率为染色体不平衡,后者有发生胚胎种植失败、流产、死胎、畸形等不良结局可能。夫妇双方来生殖中心要求对剩余囊胚进行植入前遗传学检测。签署知情同意书后对4枚冷冻囊胚解冻复苏、透明带打孔、活检,活检后囊胚再次玻璃化冷冻。我院遗传中心对活检细胞进行全基因组扩增、采用微阵列比较基因组杂交方法(array-CGH,Agilent平台)行遗传学检测。结果回报2个为整倍体囊胚、2个为非整倍体囊胚。人工周期准备内膜,选择1个整倍体囊胚进行FET,常规黄体支持用药,移植后12 d测血清HCG 224 U/L,移植后28 d B超示宫内单胎存活,孕39周剖宫产一男婴,体重3 000 g,发育正常。

二、相似病例Midway PGD/PGS

我院近年来共完成16例Midway PGD/PGS检测,其中7例是因为后发生的RSA诊断,6例为不良孕史(包括流产物微缺失微重复检测异常1例、胎儿多发畸形引产2例、胎儿/出生儿21三体3例),3例为迟检测到的染色体核型异常。共活检了57个冷冻复苏囊胚,均采用array-CGH方法检测。结果非整倍体胚胎31个、整倍体胚胎24个、无信号胚胎2个,可用胚胎率为42.1%。11人有可用囊胚,其中10人共FET 13周期,结果6周期未孕、1周期自然流产、4周期继续妊娠随访中,2周期足月产(表1)。可用胚胎率和临床妊娠率均相似于我中心同期计划PGD/PGS(分别为42.1% vs.28.57%,53.8% vs.57.38%)[1]。

表116例Midway PGD/PGS病例一般情况及治疗结果

三、讨论

计划PGD/PGS在胚胎实验室的流程为:取卵→ICSI受精→D3胚胎期打孔→D5囊胚活检→囊胚冷冻→对回报可用囊胚择期行解冻移植。而在Midway PGD/PGS,实验室流程被动变为取卵→IVF受精→囊胚冷冻→囊胚解冻复苏→囊胚打孔、活检→再次囊胚冷冻→对回报可用囊胚择期再次行解冻移植。那么以下问题就需要探讨:(1)PGD/PGS能否采取IVF受精?(2)囊胚期打孔是否可行?(3)反复冻融对胚胎发育有无影响?为此我们复习了多项PGD/PGS指南,包括2004年PGD国际协会颁布的PGD技术指南及于2008年修正的PGD操作流程及实验室质量保障指南[2]、欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD联盟就PGD实验室的设立及相关的3项技术——DNA扩增技术、荧光原位杂交(FISH)技术和胚胎活检——建立的相关指南[3-5]、2015年Tur-Kaspa等[6]提出的用于HLA配型的PGD指南及Girardet等[7]2016年提出的囊性纤维瘤PGD指南、加拿大妇产科医生协会2015年发布的胚胎植入前基因诊断和筛查技术指南[8],以及其他相关文献,以期回答上述问题。

1.PGS/PGD受精采用ICSI还是IVF:选择ICSI的理由包括:(1)增加2PN率,提高卵子利用效率;(2)避免精子来源的污染。因此目前所有指南对包含PCR步骤的PGS/PGD均推荐使用ICSI,目的即是减少来自黏附于囊胚透明带的父系精子DNA污染;荧光原位杂交(FISH)则IVF和ICSI受精两者均可[5,9]。进一步细分,所有PGD中授精步骤均推荐使用ICSI而非常规授精[4,10];而对于PGS,目前美国CooperGenomics公司采用IVF受精,并将此写入其认证的操作流程。他们的依据在于,对多达50条的精子进行扩增后并无DNA产物,因此无需担心粘附于透明带上的精子污染。但对PGD病例仍要求采用ICSI授精,尤其是采用短串联重复序列多态性连锁分析(STR-PCR)扩增进行单基因PGD时,因为细胞裂解过程可放大精子物质。由于所用扩增方法不同,导致精子DNA扩增程度也不同,因此采用何种受精方式建议参考各实验室流程、单细胞扩增技术和验证流程。此外,还需要关注另一种污染,即卵丘细胞污染。有一例胚胎PGD诊断结果为46,XX,但新生儿出生为46,XY,其DNA指纹显示为母体来源。推测原因可能是把一团粘附的滤泡细胞误认为是脱出的滋养层细胞进行了“活检”。不管采用哪种受精方法都有发生这种污染的可能,因此操作人员在活检过程中仔细识别活检材料非常重要。

2.解冻囊胚打孔(zona breaching):针对囊胚期活检,指南中推荐在胚胎期打孔、在囊胚期对从孔中突出的滋养外胚层细胞进行活检[1]。但也有缺点:若后期形成的内细胞团位于打孔处,则活检操作可能损伤已分化的内细胞,影响后续胚胎发育[11-13];效率低——打孔的胚胎不一定都能发育成囊胚。也有文献尝试在囊胚期打孔[14]。相较卵裂期打孔,囊胚期打孔优点在于:(1)打孔位置可选择,可避开内细胞团附着处;(2)避免对囊胚发育过程的干扰。但该方法需要先对囊胚进行皱缩、等到囊胚再次复张并孵出才能活检,部分情况下当天是无法完成活检。本研究中为解冻囊胚,操作时可以选择合适时机,即在囊胚解冻后尚有一定程度皱缩状态下、选取远离内细胞团处、透明带薄、且和滋养外胚层有一定间隙处打孔,然后放置培养箱孵育,待有滋养外胚层细胞从打孔处突出时取活检,则可以最大限度避免对滋养外胚层细胞的损伤。

3.反复冻融对胚胎发育的影响:冷冻技术是PGD/PGS过程中一项重要步骤,为囊胚活检后的遗传检测赢得了时间。目前采用的玻璃化冷冻技术经20多年的发展,目前已广泛用于人类卵母细胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的冷冻,获得了较高的解冻复苏率,很多文献报道冻融胚胎和冻融囊胚移植是可行和安全的[15-17]。但目前尚缺乏对玻璃化胚胎出生婴儿终生随访的全面资料,胚胎反复冻融其临床有效性、安全性更需人们关注。临床工作中胚胎反复冻融大都为特殊情况下的非常态操作,相关的研究较少。2015年的一项研究显示,重复冷冻组的胚胎种植率、临床妊娠率比单次冷冻组低[18];最新的一篇文献也显示反复冻融组自然流产率高于对照组而活产率低于对照组[19]。二次冻融影响妊娠结局可能与多个因素相关。首先,多次玻璃化冷冻过程中使用较高浓度的冷冻保护剂可使细胞发生毒性效应和渗透性休克。现普遍认为,乙二醇是人胚胎、受精卵、卵母细胞玻璃化冷冻最有效的低毒性冷冻保护剂,冻融后存活率高,但其与胚胎接触时间过长(>2 min)、温度过高(>25℃)时,其细胞毒性作用增强。其次,尽管认为玻璃化冷冻中极少有胞内冰晶形成,但当预平衡或暴露于玻璃化溶液中时间过短时,会发生细胞脱水和冷冻保护剂置换不充分,此时会产生胞内冰晶,对细胞造成损伤。反复冷冻情况下这些不良事件发生概率增加、不利影响累加,最终可能影响到胚胎发育潜能。这就要求胚胎学家操作严格按照流程进行,同时也要求我们工作中尽可能个体化处理、准确预判,任何情况下都要尽可能避免对胚胎反复冻融。

总之,中途行PGD/PGS与计划行PGD/PGS在操作程序有诸多不同,现有指南未涉及,目前无指导性建议。其中IVF受精、反复冻融有可能影响PGD准确率和胚胎进一步发育潜能,如何评价其效果有待进一步积累经验。

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