母胎亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与不明原因习惯性流产发生风险的相关性研究

李乾，常亮，刘平，刘娟，路建波,高华方，马旭

(1.国家卫生计生委科学技术研究所国家人类遗传资源中心，北京 100081；2.北京大学第三医院妇产科生殖医学中心，北京 100191)

习惯性流产(recurrent pregnancy loss，RPL)是指2次或2次以上的自然流产(约70%孕期不满12周流产)，国际上多称之为复发性自然流产，临床发病率约2%～5%[1]。RPL发生的病因非常复杂，大致包括遗传因素[2]、自身免疫[3]、组织结构因素[4]、感染因素[5]、内分泌因素[6]和其他因素[7]，但仍然有50%～70%的RPL患者无法明确原因[8]，称为不明原因习惯性流产(unexplained recurrent pregnancy loss，URPL)。研究表明亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性通过影响血清同型半胱氨酸(Hcy)水平及DNA甲基化而造成URPL[9]，但还存在一定的争议[10]。本研究拟纳入URPL及有正常妊娠史的女性及胎儿，探究母体及胎儿自身MTHFR基因C677T多态性与URPL的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选取2014年12月至2016年12月在北京大学第三医院妇产科生殖医学中心就诊的URPL患者100名为病例组。纳入标准：年龄≤40岁、流产史≥2次；排除标准：染色体异常、抗核抗体阳性、妊娠高血压、糖尿病史、抗心磷脂抗体阳性、甲状腺功能异常、生殖系统解剖畸形、五种胎儿致畸病毒(TORCH)感染阳性、配偶生殖功能异常等患有明确引起流产的疾病。同时，100名URPL患者中收集到了配对的70例流产胎儿绒毛组织(均为9～13周内，胚胎发育停滞，行清宫术取样)。另征集100名有正常妊娠史的健康志愿者作为对照组，其中70例有胎儿脐带血样本。

本研究开始前经北京大学第三医院生殖伦理委员会审查批准(编号2015SZ-025)，所有研究对象均签署知情同意书。

二、研究方法

1.样本采集：(1)病例组样本采集：胚胎发育停滞患者，行常规负压吸引清宫术，无菌条件下留取绒毛组织2 cm×2 cm，生理盐水充分漂洗，放入无菌器皿中；同时抽取患者外周静脉血2 ml，枸缘酸钠抗凝管-80℃保存。(2)对照组样本采集：胎儿娩出后，常规断脐，脐静脉穿刺取脐带血，本研究留脐带血2 ml，枸缘酸钠抗凝管-80℃保存；同时抽取产妇外周静脉血2 ml，枸缘酸钠抗凝管-80℃保存。

2.基因分型检测方法：基因检测采用BaiO©核酸提取试剂(上海百澳科技)提取血液及绒毛组织基因组DNA，采用BaiO©MTHFR(C677T)基因检测试剂盒[上海百澳科技，PCR-芯片杂交法国食药监械(准)字2012第3401329号]检测MTHFRC677T 基因多态性位点，操作按说明书进行。血样本加蛋白酶K短暂离心，加入200 μl缓冲液BL，500 r/min低速离心15 s，裂解细胞，活化吸附柱后转移至吸附柱中，洗脱获得DNA。PCR扩增时向扩增液中各加入1 μl反应液(冰上操作)。向扩增液中加入2 μl对应样本的模板DNA(冰上操作)，低速离心混匀。运行扩增程序：50℃ 5 min，94℃5 min，(94℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃ 25 s)，72℃5 min。最后芯片杂交显色。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0统计数据包进行两组间基因型、等位基因频率进行分析。URPL病例组与对照组两组间等位基因频率采用χ2检验进行分析；两组间母体-胎儿同时携带T等位基因频率采用Fisher精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、URPL病例组与对照组MTHFR C677T位点基因型及等位基因频率比较

基因型频率统计结果提示，对照组C/C基因型频率显著高于病例组C/C基因型频率(P<0.05)，两组C/T基因型频率比较无显著性差异(P>0.05)；病例组T/T基因型频率显著高于对照组T/T基因型频率(P<0.05)；另外病例组等位基因T频率显著高于对照组基因T频率，且病例组中等位基因T频率显著高于基因C频率，而对照组等位基因C频率显著高于病例组基因C频率(P<0.05)(表1)。

表1 URPL病例组和对照组MTHFR C677T基因型频率及等位基因频率比较结果[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05

二、URPL病例组与对照组配对母体-胎儿同时携带MTHFR 677位T等位基因比较

URPL病例组配对的母亲和胎儿至少有一个为C/C基因型的配对组有18对，频率为25.7%；配对的母亲和胎儿同时携带T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配对组有52对，频率为74.3%。对照组配对的母亲和胎儿至少有一个为C/C基因型的配对组有33对，频率为47.1%；配对的母亲和胎儿同时携带T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配对组有37对，频率为52.9%。病例组和对照组配对的母亲和胎儿同时携带T等位基因的频率差异有统计学意义(Fisher精确检验，P=0.014)，病例组显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 URPL病例组和对照组母体-胎儿同时携带MTHFR 677位T等位基因频率比较结果[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

流行病学发现，复发性流产发生率约占全部妊娠的2%～5%[1]。除明确的遗传因素、自身免疫、组织结构因素内分泌因素和其他因素外，约有一半以上的患者发病原因仍然不明[11]。该疾病给家庭带来巨大的精神压力和经济压力，成为近年来的研究热点。

既往研究发现MTHFRC677T多态性与URPL可能存在相关性[12-14]。MTHFR是叶酸代谢过程中的关键性的酶，对5，10-亚甲基四氢叶酸还原成为5-甲基四氢叶酸起催化作用。MTHFR基因677位等位基因C变为T会导致MTHFR酶耐热性和活性下降甚至丧失，酶活性降低会导致5-甲基四氢叶酸合成减少，5-甲基四氢叶酸为Hcy提供一碳单位使其甲基化为甲硫氨酸，5-甲基四氢叶酸合成减少使Hcy不能甲基化为甲硫氨酸而造成Hcy堆积，导致血清Hcy水平升高[15-16]。Hcy具有细胞毒性可以使巯基氧化，细胞内产生大量氧自由基，损伤血管内皮并增加血栓形成风险，影响子宫胎盘血流灌注，导致胚胎血液供给不足影响生长发育从而使流产风险升高[17]。另外，MTHFR酶活性降低影响甲硫氨酸合成效率，导致甲基供给异常，出现DNA甲基化不足和DNA合成障碍，胚胎发育期甲基化异常导致胚胎正常发育失败，最终将导致出生缺陷或者胚胎停育[18-19]。

高Hcy血症可能是URPL的风险因子之一，但由于本研究纳入的URPL组中的部分患者已服用叶酸进行治疗，入组本研究时患者的血清Hcy水平已经大幅度降低。此外，影响血清Hcy水平的因素很多，包括年龄、性别、BMI[20]、饮食中是否摄入含大量蛋氨酸的食物[21]等，Hcy一次的检测结果难以反映患者妊娠时真实的水平。因此，本研究未将病例及对照Hcy水平纳入研究，而是关注URPL组与对照组MTHFR基因 C677T位点基因分型，结果显示URPL组中MTHFRC677T位点T等位基因频率显著高于对照组，支持MTHFRC677T位点T等位基因是URPL的高风险因子。

目前，胎儿本身的MTHFRC677T等位基因是否与URPL相关的研究比较少见，曾有报道认为夫妻配对研究可以间接地反映子代MTHFRC677T基因型，王亚文等[22]对32对有两次及两次以上URPL史的夫妇和39对健康夫妇进行MTHFRC677T相关性研究，结论认为子代携带MTHFR纯合或杂合突变可能是胚胎早期发育异常的原因之一，从而导致流产的发生。顾莹等[23]对URPL组和对照组各50对夫妇的外周血进行MTHFRC677T的位点多态性进行检测分析本研究结果显示，夫妇双方T等位基因频率在URPL组显著升高。本研究直接检测与母体配对的流产胎儿组织样本，分析结果显示配对的母体和胎儿均携带T等位基因时，URPL风险进一步升高。推测其原因，一方面母亲携带T等位基因，自身MTHFR酶活性降低，易发生Hcy堆积而使胎盘形成血栓风险升高，影响胚胎血液供给；另一方面胎儿自身携带T等位基因时，高Hcy产生细胞毒性，激发某些信号转导途径和控制系统，诱发细胞凋亡，影响胚胎早期重要的心脏、神经系统等的发育。因此，母体和胎儿均同时带T等位基因增加了URPL风险，进一步推测，对于夫妻双方均携带有T等位基因时，鉴于其遗传给胎儿的几率较大，因此应该密切关注其可能流产的风险。

综上所述，本研究的结果显示MTHFR677位 T等位基因是URPL的风险因素之一，为MTHFRC677T基因型与URPL相关性研究提供了一定的实验依据和资料积累。但是，本研究URPL病例组和对照组样本数量较少，日后还需要积累更多样本量继续验证工作。本研究的结果提示对于无法寻找出原因的习惯性流产患者，建议进行MTHFRC677T基因型的筛查，同时，如果有条件获取胎儿MTHFRC677T基因型时，应该密切关注母胎均携带MTHFR677位T等位基因的孕妇流产风险，并后续有针对性地进行预防和治疗。