LC-MS/MS法测定比格犬血浆中米非司酮的方法学建立

郭永，贾重阳，许保海，3，涂鹏程，4，裴开颜*

(1.国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081；2.兰州市第二人民医院，兰州 730046；3.遵义医学院细胞生物学教研室，遵义 563003；4.北京协和医学院，北京 100730)

米非司酮是1981年由法国Roussel-Uclaf公司首家生产的19-去甲睾酮衍生物，是一种受体水平的甾体类激素拮抗剂，与孕激素受体的结合力较黄体酮强6～8倍。自米非司酮作为终止早孕的药物用于临床以来，经过20多年的摸索实践，米非司酮在临床上得到广泛运用，主要应用于终止早孕、紧急避孕、药物流产[1]和治疗子宫肌瘤[2-3]、子宫内膜异位症[4-5]、库欣综合征[6]、胰岛素抵抗[7]、乳腺癌[8]、子宫内膜癌[9]以及皮肤老化[10]等。米非司酮口服后吸收良好，但因存在肝脏首过效应，部分药物被代谢而致生物利用度降低，故欲对其低剂量药代动力学特征进行研究，则需要建立高效灵敏的分析方法。目前文献报道的米非司酮检测方法，多为高效液相色谱(HPLC)法[11-13]和放射免疫分析法(RIA)[14]等。随着分析技术的不断进步，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)应用于临床化学的检测领域，由于LC-MS/MS法分析速度快、灵敏度高，近年来被认为是痕量定量分析的金标准。本文旨在建立一种简单快捷、灵敏度高的LC-MS/MS法测定比格犬血浆中米非司酮的浓度，为进行口服低剂量(25 mg)米非司酮片的人体药动学研究奠定基础。

材料和方法

一、动物及材料

1.实验动物：比格犬，雌性，普通级，8～12 kg，购自北京玛斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0001。试验动物检疫观察14 d，观察动物的外观体征、行为活动、粪便性状、体重及饮食等指标，发现有病动物及时剔除。动物使用前经动物管理人员和专题负责人检查认可。

动物房环境条件控制室温18℃～24℃，相对湿度40%～70%，光照12 h明暗交替。笼具、食盒、饮水瓶每天冲洗一次，动物房地面和墙面每周消毒一次，用0.1%新洁尔灭或0.5%的84消毒液擦拭消毒，两种消毒液交叉使用。普通饲料为犬维持料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饮水：饮用纯化水，经酸化后自由饮用。

2.仪器：API 4000 Qtrap液相色谱-质谱联用仪(AppliedBioSystem，美国)，包括：API 4000 Qtrap三重四极杆质谱、配有ESI源、Analyst 1.5.2数据处理系统；液相部分为Agilent1200高效液相色谱，配有G1312A二元溶剂输送泵、G1367A自动进样器、G1379A脱气机、G1316A柱温箱。十万分之一分析天平DENVER Instrument TB-25(max 21 g，d=0.01 mg)；美国Labnet VX-100涡旋振荡器(VORTEX)；低温高速离心机5810R(Eppendorf，德国)；4℃、-20℃、-80℃ 冰箱(青岛海尔)。

3.试剂：米非司酮标准物质：纯度>99%，批号72801608006(秦皇岛紫竹药业)；内标物特非那定(Sigma，美国)；甲醇(批号170237)、甲酸(批号174477)、乙腈(批号168772)、DMSO(批号155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批号166804)均为色谱纯(Fisher Scientific，美国)。

4.对照品溶液的制备：(1)首先配置标准品母液，用DMSO配制1 mg/ml的米非司酮溶液备用。(2)标准溶液的配置：由1 mg/ml的米非司酮母液用甲醇依次稀释成标准系列浓度(10、20、50、200、500、2 000、5 000、10 000 ng/ml)的溶液。(3)标准曲线浓度点为：1、2、5、20、50、200、500、1 000 ng/ml。

5.内标溶液制备：用甲醇/乙腈(1/1，v/v)溶液将特非那定母液稀释成浓度为50 ng/ml的内标溶液备用。

6.质控(QC)标准溶液：最低定量下限(LLOQ)、低、中、高四标准溶液浓度为：10、20、500、8 000 ng/ml，LLOQ、低、中、高四浓度点分别为：1、2、50、800 ng/ml。

7.试剂的保存：4℃保存。

二、方法

1.给药及血浆样本采集：(1)静脉给药：比格犬，3只，雌性，静脉注射米非司酮1 mg/kg。给药前及给药后5、15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血浆样本。(2)单次灌胃给药：比格犬，雌性，每给药剂量3只，分别给予米非司酮灌胃1、3、10 mg/kg。给药前及给药后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血浆样本。(3)多次灌胃给药：比格犬，3只，雌性，分别给予米非司酮灌胃3 mg/kg，给药间隔4 d或7 d，连续给药7次。首次和末次给药前，给药后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h以及第7、14、21、28、35、42 d采集血浆标本。

对照组血浆样本采自非静脉及灌胃给药的比格犬。标本采集后EDTA抗凝，24 h以内的血浆保存于-4C冰箱，24 h以后冻存于-80C冰箱。

2.色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18 110 A column(3 mm×30 mm ID，2.6 μm，phenomenex)；流动相：A相，甲醇(含0.1%甲酸)；B相，水(0.1%甲酸)；流速：0.8 ml/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

3.质谱条件：以多反应监测模式(MRM)监测离子对(米非司酮：430.2→372.3；内标特非那定：472.2→436.2)的离子流。离子喷雾电压5 500 V；离子源温度为550℃；离子源Gas1 60 psi；离子源Gas2 60 psi；气帘气12 psi。

4.标准曲线的制备：取空白血浆50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定内标溶液，再加入5 μl标准溶液，500 μl的甲基叔丁基醚(MTBE)，充分涡旋3 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清400 μl，氮气吹干后，用150 μl的甲醇/水(1∶1)复溶，充分涡旋1 min后直接进样。

5.QC样品的制备：取空白血浆50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定内标溶液，再加入5 μl标准溶液，500 μl的MTBE，充分涡旋3 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清400 μl，氮气吹干后，用150 μl的甲醇/水(1∶1)复溶，充分涡旋1 min后直接进样。

6.回收率样品的制备：取空白血浆50 μl，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl 甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分涡旋3 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清400 μl，氮气吹干后，加入4 μl标准溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定内标溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分涡旋1 min后直接进样分析。

7.基质效应样品的制备：取50 μl水，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分涡旋3 min后，4 000 r/min 离心10 min，取上清400 μl，氮气吹干后，加入4 μl标准溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定内标溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分涡旋1 min后直接进样分析。

8.专属性检测：取6份不同来源比格犬空白血浆。将实验比格犬空白血浆分析色谱图与加药后比格犬血浆色谱图进行比较，观察比格犬血浆液液萃取后有无内源性干扰物质，对待测物和内标物峰形有无明显干扰。

9.标准曲线线性范围：血浆中药物标准曲线浓度点为1、2、5、20、50、200、500和1 000 ng/ml。以米非司酮的浓度X(ng/ml)为横坐标，以米非司酮的峰面积和内标峰面积的比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法(W=1/X2)进行回归计算，所得直线回归方程即为标准曲线。定量下限是标准曲线上的最低浓度点。

10.精密度(RSD)与准确度(RE)：选择LLOQ、低、中、高4个浓度点(1、2、50和800 ng/ml)，平行样6份，作为日内RSD。连续检测3 d，作为日间RSD。随行标准曲线，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，采用单因素方差分析法计算RSD和RE。

11.稳定性检测：本实验通过比较样品在5种存放条件下的准确度，检测样品在分析前、中、后期的稳定性。(1)血浆样品室温放置5 h，低、高两个浓度点平行样6份；(2)血浆样品3次冷冻、解冻循环稳定性，低、高两个浓度点平行样6份；(3)血浆样品-80℃长期稳定性40 d，低、高两个浓度点平行样6份；(4)血浆样品处理后4℃放置24 h稳定性，低、高两个浓度点平行样6份；(5)米非司酮和内标储备液4℃ 40 d储存稳定性，两个不同日期溶液平行样6份。

12.提取回收率：低、中、高三浓度点(2、50和800 ng/ml)平行样6份，通过QC样品平均峰面积比相应浓度的回收率样品的峰面积，计算每个浓度样品和内标的回收率。

13.基质效应：低、中、高三浓度点(2、50和800 ng/ml)平行样6份，采集峰面积C，通过公式B/A×100%计算基质效应。

14.血浆样品稀释可靠性：配置浓度为4 000 ng/ml血浆样品，将其稀释5倍，平行样6份。

结 果

一、方法专属性

将实验比格犬空白血浆分析色谱图(图1)与加药后比格犬血浆色谱图(图2)进行比较，分析结果显示比格犬血浆液液萃取后无内源性干扰物质，对待

A：米非司酮；B：内标图1 比格犬空白血浆色谱图

A：米非司酮；B：内标图2 加药后比格犬血浆色谱图

测物和内标物峰形无明显干扰。该LC-MS/MS方法的专属性较好，米非司酮保留时间为2.11 min，特非那定保留时间为2.22 min(图2)。

二、标准曲线与定量下限

通过配制的不同浓度样品进样分析，记录色谱图(图3、4)，通过直线回归计算，得出直线回归方程，

A：米非司酮；B：内标图3 标准曲线1 ng/ml色谱图

A：米非司酮；B：内标图4 标准曲线1 000 ng/ml色谱图

即为标准曲线。结果显示：标准曲线相关系数4次均>0.99，说明米非司酮在1～1 000 ng/ml范围内线性关系良好。方法灵敏度方面，LLOQ为1 ng/ml，信噪比(S/N)>10。LLOQ RSD为10.4%，RE为99.6%(表2，图5)。

三、RSD与RE

实验结果如表3所示，QC样品的日内RSD≤11.6%，日间RSD≤9.9%，日内RE≤11.1%，日间RE≤7.8%。结果显示，该方法符合FDA生物样品分析方法指南的要求，重复性较好，可用于检测比格犬血浆中的米非司酮。

四、稳定性

本实验通过比较样品在5种存放条件下的准确度，检测了样品在分析前、中、后期的稳定性。存放条件包括：室温放置5 h、4℃放置24 h、-80℃反复冻融3次、-80℃长期稳定性40 d以及米非司酮和内标储备液4℃ 40 d储存稳定性。实验结果显示，储备液室温放置5 h稳定(RE：-5.42%～-4.19%)，4℃放置24 h稳定(RE：-3.75%～-2.72%)，-80℃反复冻融3次稳定(RE：-5.42%～-7.10%)，长期稳定(RE：-0.42%～0.48%)，以及米非司酮和内标储备液4℃ 40 d储存稳定(表4)。实验结果显示，待测物基本没有被降解，在整个实验过程中基本稳定。

表2 LLOQ数据表

A：米非司酮；B：内标图5 LLOQ色谱图

批 次浓度(ng/ml)加入量测得量RSD(%)RE(%)批内1次1 1.03±0.113.0211.602 1.87±0.19-6.7511.105044.97±1.91-10.104.65800859.33±34.057.424.34批内2次1 0.89±0.06-11.107.532 1.89±0.17-5.5810.005054.05±3.368.106.80800737.83±67.74-7.7710.10批内3次1 0.92±0.08-7.7010.002 1.78±0.06-11.103.955047.58±1.83-4.834.22800717.83±26.56-10.304.05批间1 0.95±0.07-5.267.772 1.85±0.06-7.813.145048.90±4.69-2.279.57800771.67±76.29-3.549.92

表4 米非司酮和内标储备液4℃ 40 d储存稳定性

五、基质效应和提取回收率

结果显示，米非司酮在比格犬血浆的基质抑制率均<15%(表5)，表明不存在明显的基质效应；通过公式C/B×100%计算提取回收率，结果显示米非司酮回收率为91.5%～104.0%(表5)。

六、稀释效应

配置浓度为4 000 ng/ml血浆样品，将其稀释5倍，稀释后浓度800 ng/ml，平行做6份(浓度测定值分别为806、723、724、720、827、697 ng/ml)。结果显示RSD 7.10%，RE -6.31%，均符合要求。

表5 LC-MS/MS法测定米非司酮的基质效应和回收率

讨 论

米非司酮是一种抗孕激素，鉴于其可作用于月经周期不同时相，且半衰期较长，研究人员考虑将其用于常规避孕。本课题组曾对25 mg和50 mg米非司酮每周一次口服的临床效果进行初步研究[15]。并在此基础上，又在全国7家研究所/医院完成了对502名妇女(3 006个研究周期)每周一次口服25 mg米非司酮的临床观察[16]。研究结果均提示有希望将米非司酮每周一次口服发展为常规避孕方法。另一方面，体内外研究均表明米非司酮对于子宫肌瘤等具有很好的治疗作用，但目前适宜剂量和方案尚在探索之中。鉴于米非司酮每周一次口服的避孕效果，及其对多种疾病的治疗作用，考虑可将其用于特定人群，如子宫肌瘤、子宫内膜异位症患者，发挥避孕和治疗疾病的双重功效。目前已获得国家食品药品监督管理局(CFDA)认证，药物说明书中明确的仅为将10 mg米非司酮用于成年育龄女性有中重度症状的子宫肌瘤术前治疗。同时，鉴于根据CFDA颁布的《药品注册管理办法》(局令第28号)，在进行临床试验之前，需要对米非司酮避孕适应症进行临床前研究，评价其安全性和有效性，因此有必要进行每周一次口服25 mg米非司酮的药代动力学研究，为米非司酮作为兼有治疗作用的避孕药物申请临床研究做准备。

目前报道的生物样本中米非司酮的分析测定方法主要有HPLC法[11-13]和RIA[14]。这两种方法试剂价格昂贵、步骤繁琐；RIA法因存在放射性污染，且操作较为烦琐，不宜推广使用；HPLC虽然测定较为准确，但仍存在标本流动相配置复杂，检测时间长，LLOQ较高等问题[17-18]。杨林等[19]采用LC-MS/MS法测定人血浆中米非司酮浓度，其LLOQ值为10 ng/ml，上样量为200 μl。林琳等[20]也采用LC-MS/MS法测定两种米非司酮片人体生物学效性，其LLOQ值为10.29 ng/ml，上样量为200 μl。研究文献中报道的LC-MS/MS法，灵敏度虽已较高，但仍不能满足本研究对低剂量米非司酮药代动力学研究的需要，且部分方法操作较为烦琐，有待于进一步简化。

本研究在灵敏度、样品前处理和样本需求量等方面进一步优化分析条件，所建立的LC-MS/MS法测定比格犬血浆中的米非司酮，线性范围宽(1 000倍)，灵敏度高，血浆中米非司酮的线性范围均为1～1 000 ng/ml，样品回收率高，能够满足给药后各个时间点血浆药物浓度的测定。在本测定条件下的稳定性考察中，米非司酮含药基质的各浓度偏差均在±15%以内，能够保证检测结果的准确性和重现性。本研究所建立的分析方法灵敏度可达1.0 ng/ml，且所需样本量仅为血浆50 μl，为进行每周口服25 mg米非司酮片的人体药动学研究奠定基础。