不同温度下氟苯尼考在大菱鲆体内的药代动力学研究*

陈 钊，罗 强，常志强

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室,山东 青岛 266071；3.中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003；4.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)鲽形目(Pleuronectiformes)菱鲆科(Scophthalmidae)菱鲆属(Scophthalmus)，是原产于欧洲沿海的一种名贵比目鱼，在中国又称多宝鱼，具有生长迅速、肉味鲜美、经济价值高等优点[1]。中国水产科学研究院黄海水产研究所于1992年将大菱鲆引入我国，先后突破了大规模育苗和养殖关键技术，经过多年的研究与推广，已发展成为我国北方沿海工厂化养殖业的主导品种之一。2016年我国大菱鲆养殖总产量4.5万t，占世界养殖总产量80%，主要以工厂化养殖为主[2]。伴随着大菱鲆养殖业的迅猛发展和集约化程度的不断提高，养殖病害也频繁发生，由于化学抗生素类药物具有成本低、见效快、操作简单等特点，目前仍然是预防和控制养殖鱼类病害的主要方法。

水产用抗菌药几乎全部来源于人药或兽药，但鱼类不仅在解剖结构、生理功能和用药环境等方面与人类、畜产动物存在明显差异，而且是变温动物，机体代谢活动易受外界环境温度变化影响，因此，针对人类或畜产动物开发的药物不能简单移植应用于鱼类病害防治，需要开展相应的代谢动力学研究，指导养殖生产安全用药。

氟苯尼考(Florfenicol)又称氟甲砜霉素，是由美国先灵葆雅动物保健公司(Schering-Plough Animal Health)在1980年代后期研发的一种兽用氯霉素类广谱抗菌药。氟苯尼考对气单孢菌(Aeromonas)、链球菌(Streptococcus)、弧菌(Vibrio)和爱德华氏菌(Edwardsiella)等病原菌引起的鱼类疾病也有明显的防治效果，已被中、美、日、韩等25个国家批准应用于水产养殖，是世界范围内水产养殖中应用最广泛的药物之一。目前，国内外学者已研究了氟苯尼考在大西洋鲑(Salmosalar)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)、罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)、点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)、Piaractusmesopotamicus、鲫(Carassiusauratuscuvieri)、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、鲶鱼(Silurusasotus)、黄鳝(Monopterusalbus)和克氏原螯虾(Procambarusclarkii)等体内的代谢动力学特征[3-17]。但关于该药物在大菱鲆体内的代谢动力学研究尚未见报道。本研究以氟苯尼考为试验药物，设定不同养殖温度，比较氟苯尼考在大菱鲆体内的代谢动力学特征，以期为大菱鲆养殖生产中科学合理使用氟苯尼考提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验在烟台开发区天源水产有限公司进行。健康大菱鲆体质量481～546 g，养殖于30 m2水泥池，流水养殖，连续充气，盐度30，pH 8.1～8.2，利用过滤海水和地下深井海水分别调节养殖水温为14和17 ℃。大菱鲆无用药史，试验前暂养2周，投喂大菱鲆专用配合饲料。

1.2 实验药品

氟苯尼考标准品，购自中国兽药监察所，纯度≥99%；氟苯尼考注射液(1g/10 mL)购自潍坊鸢城兽药有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自Sigma公司，乙酸乙酯、正己烷为国产分析纯。

1.3 实验仪器

高效液相色谱仪(Agilent1200)，配备四元泵、紫外检测器和Agilent TC-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；内切式高速分散均质机(XHF-D)；水浴加热氮吹仪(HSC-24B)；漩涡振荡器(XW-80A)；Eppendorf高速离心机等。

1.4 给药与采样

实验分4组，分别为14 ℃静注、14 ℃口灌、17 ℃静注和17 ℃口灌，每组100尾鱼。试验鱼在给药前禁食24 h，给药后96 h内正常投喂配合饲料，自由采食。农业部《新编渔药手册》推荐鱼类口服氟苯尼考剂量为7～15 mg/kg BW，选择上限15 mg/kg BW作为本试验中静注和口灌给药剂量，以期获得明显试验效果。静注给药时，先用棉质毛巾将鱼体包裹以防止鱼体剧烈挣扎，尾静脉单次注射药物，然后分别于给药前(0 h)和给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、24、48和96 h随机取6尾鱼经尾静脉单次无菌采血，置于内壁经肝素钠处理的5 mL一次性采血管，4 000 r/min离心10 min分离血浆，将血浆转移到新离心管中-20 ℃冰箱保存备用。采血后的试验鱼被移出试验池弃用。

口灌给药时，先用棉质毛巾将鱼体包裹以防止鱼体剧烈挣扎，用弃去针头的1 mL无菌注射器吸取400 μL饲料混悬液，根据鱼体重添加一定量的氟苯尼考注射液后从口部将含药混合液单次灌入大菱鲆胃部，然后分别于给药前(0 h)和给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、16、24、48和96 h随机取6尾鱼经尾静脉单次无菌采血，置于内壁经肝素钠处理的5 mL一次性采血管，4000 r/min离心10 min分离血浆，将血浆转移到新离心管中-20 ℃冰箱保存备用。采血后的试验鱼被移出试验池弃用。

试验期间各组试验鱼均未出现死亡。

1.5 样品处理

血浆样品在室温下自然解冻，移取1 mL置于10 mL离心管中，加入乙酸乙酯4 mL，于漩涡振荡器上振荡5 min，室温静置2 h，然后5 000 r/min条件下离心15 min，吸取全部上清液于新的10 mL离心管中，40 ℃恒温水浴条件下氮气吹干，残留物用1 mL流动相漩涡振荡溶解，再加入2 mL正己烷去除脂肪，漩涡振荡，室温条件下，静置2～3 h，仔细除去上层正己烷，处理过的样品经0.22 μm滤膜过滤后，用高效液相色谱仪测定样品中药物含量。

1.6 色谱条件

流动相：乙腈∶水=27∶73(v∶v)；紫外检测器，波长：223 nm；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

1.7 标准曲线确定

准确称取氟苯尼考标准品0.01 g，用新配制的流动相配成100 μg/mL的母液(适量甲醇助溶)，然后用流动相依次稀释成50.00、25.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05、0.025、0.01 μg/mL的氟苯尼考标准溶液，依次从低浓度到高浓度进行HPLC检测，记录各浓度的峰面积。以检测的峰面积为纵坐标，氟苯尼考各标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。最低检测限的确定参照王翔凌等[18]方法。

1.8 回收率和精密度的测定

回收率：准备2组浓度为0.1、1和10 μg/mL的氟苯尼考标准液各1 mL。一组分别加入0.5 mL空白血浆中，每个浓度3个平行，样品经处理后进行HPLC测定，另一组氟苯尼考标准溶液直接进行HPLC测定，按如下公式计算回收率：

回收率=(样品处理后标准溶液液的测定值/标准溶液的测定值)×100%。

精密度：取0.1、1和10 μg/mL不同浓度氟苯尼考标准溶液，加入空白血浆中，样品经处理后于1天内分别重复进样5次和连续进样5 d，计算3个浓度水平响应值峰面积的变异系数C.V(%)。

1.9 数据处理

药-时数据采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数，并以权重1、1/C和1/C23种情况拟合一室、二室和三室模型，根据AIC和R2值来判断最佳房室模型。

2 结果

2.1 检测方法

氟苯尼考在0.025～100 μg/mL浓度范围内有良好的相关性，线性回归方程为：Y=53.701X-0.705，相关系数R2=0.999 9(见图1)。本检测方法最低检测限为0.025 μg/mL。本实验条件下，氟苯尼考在血浆中的回收率范围在79.9%～86.4%之间；日内和日间精密度范围分别为1.7%～3.6%和2.8%～4.4%，均在10%以内，符合生物测定方法要求。

图1 氟苯尼考标准曲线Fig.1 Standard curve of florfenicol

2.2 氟苯尼考在大菱鲆体内的代谢动力学特征

在14和17 ℃2种温度下，分别采用静注或口灌给药方式给予大菱鲆氟苯尼考后，氟苯尼考在大菱鲆血浆中的浓度变化情况见图2和3。静注给药后0.25 h，血浆中氟苯尼考浓度分别为77.1±40.7和(98.2±57.1) μg/mL，2 h内分别快速降至37.7±3.2和(45.0±6.8) μg/mL，之后继续缓慢下降，至96 h时分别为0.4±0.0和(0.2±0.1) μg/mL。口灌给药后，血浆中氟苯尼考浓度逐渐升高，均在12 h时达到峰值(Cmax)6.5±0.9和(6.7±0.7) μg/mL，之后缓慢下降，24 h时分别降至2.7±1.8和(2.4±1.1) μg/mL，96 h时分别为0.09±0.08和(0.05±0.07) μg/mL。采用DAS2.0软件对药-时数据进行分析，结果显示：在14 ℃水温下，大菱鲆静注氟苯尼考后的药时数据可以用三室模型拟合，方程为：C静注= 417.17e-9.49 t+20.37e-0.28 t+31.17e-0.04 t；口灌氟苯尼考后的药时数据可以用二室模型拟合，方程为：C口灌= 12.34e-0.25 t+9.84e-0.05 t。在17 ℃水温下，静注氟苯尼考后的药时数据可以用三室模型拟合，方程为：C静注= 76.03e-2.17 t+15.23e-0.36 t+42.4e-0.06 t；口灌氟苯尼考后的药时数据可以用二室模型拟合，方程为：C口灌= 17.02e-0.17 t+10.78e-0.06 t。主要代谢动力学参数见表1。

图2 不同温度条件下静注给药后氟苯尼考在大菱鲆血浆中的浓度变化情况Fig.2 Change of florfenicol concentration in plasma of turbot following a single intravenous administration at different temperature

图3 不同温度条件下口灌给药后氟苯尼考在大菱鲆血浆中的浓度变化情况Fig.3 Change of florfenicol concentration in plasma of turbot following a single oral administration at different temperature

3 讨论

3.1 氟苯尼考在大菱鲆体内的代谢动力学特征

氟苯尼考是水产养殖领域中常用的抗生素，其在大西洋鲑、牙鲆、日本鳗鲡、罗非鱼、鲫、斑点叉尾鮰、鲶鱼、黄鳝等养殖鱼体内的代谢动力学特征已见报道，但针对大菱鲆开展的相关研究还未见报道。本研究在不同温度条件下给大菱鲆口灌氟苯尼考后，其体内代谢变化过程均可以使用二室开放模型描述，与鲫[11]一致。口灌给药后，氟苯尼考在大菱鲆血液中的浓度缓慢升高，12h时达到峰值(Cmax)6.5 mg/L，这与罗非鱼[6]研究结果一致，但明显慢于大西洋鲑(6 h)、牙鲆(4 h)、鲶鱼(8 h)、黄鳝(5 h)、斜带石斑鱼(4 h)、日本鳗鲡(3.4～6.5 h)和鲫(1.61 h)等其他养殖鱼类[3-4，8，11，14-15，17]；氟苯尼考在大菱鲆体内的平均消除半衰期为12.45～14.48 h，与鲶鱼(15.69 h)、黄鳝(13.46 h)、日本鳗鲡(14.99 h)、斜带石斑鱼(11.57 h)相近，明显较鲫(2.17 h)和罗非鱼(10.03 h)慢[6，8，11，14-15，17]。静注给药方式对于水产养殖动物的实际应用意义不大，但静注给药获得的代谢动力学参数是计算口服、肌注、药浴等其他给药方式的生物利用度(F)所必需的，目前仅有在斑点叉尾鮰、大西洋鲑、鲶鱼和牙鲆等少数养殖鱼类上的研究报道，本研究发现大菱鲆口灌氟苯尼考的生物利用度为17.02%～18.24%，明显低于斑点叉尾鮰(100%)、大西洋鲑(99%)和鲶鱼(92.61%)[3，12，14]，而与牙鲆(43%)[4]具有一定的可比性。与其他常见海、淡水养殖鱼类相比，大菱鲆体内氟苯尼考的吸收、分布和消除速率均较慢，这可能是因为大菱鲆属于海洋底栖鱼类，活动性差、物质代谢缓慢所致。据报道，鲆鲽鱼类较其他鱼类的鳃表面积小、心脏容积小、血红细胞压积和血红蛋白水平低、动脉血压和心输出量低、血流灌注程度也相对较低[19]。牙鲆和大菱鲆虽然同属于底栖鲆鲽鱼类，但牙鲆更偏肉食性，适温范围广，活动性强，肝代谢酶活性也较大菱鲆高[20]。

表1 不同温度条件下氟苯尼考在大菱鲆体内的代谢动力学参数Table 1 Parmacokinetic parameters of florfenicol in turbot at different temperatures

注：3室模型中，A、B和G分别为分布相Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的零时截距，α、β和γ为各期速率常数；t1/2α fast为快分布相半衰期，t1/2α slow为慢分布相半衰期，t1/2β为消除相半衰期。2室模型中，A和B分别为分布相和消除相零时截距，α和β为分布和消除速率常数；t1/2Ka为吸收半衰期，t1/2α为分布相半衰期，t1/2β为消除相半衰期，K10为药物自中央室的消除速率。Vd为表观分布容积；CL为清除率；AUC为曲线下面积；tmax，达峰时间为Cmax为峰浓度；F为生物利用度。
Notes: In three-compartment modeling，A，BandGare the zero-time drug concentration intercepts for the first，second and third phases，andα，βandγare the rate constant of slope for three phases，respectively;t1/2α fastis the fast distribution half-life，t1/2α slowis the slow distribution half-life，andt1/2βis the elimination half-life.In two-compartment modeling，AandBare the zero-time drug concentration intercepts for the distribution and elimination phase，α is the distribution rate constant，andβis the elimination rate constant;t1/2kais the absorption half-life，t1/2αis the distribution half-life，andt1/2βis the elimination half-life，K10is the elimination rate of drugs from the ceniral compartment.In addition，Vdmeans apparent volume of distribution，CLmeans body clearance，AUCmeans area under the concentration-time curves，Tmaxmeans time to reach the maximum concentration，Cmaxmeans maximum concentration，andFmeans bioavailability.

3.2 温度对氟苯尼考代谢动力学特征的影响

外界水温变化会影响鱼类体温及新陈代谢速率等生理活动，进而影响药物在体内的代谢动力学过程。鱼类学家[21]普遍认为硬骨鱼类生理代谢速率与水温成正相关性，一定范围内水温每升高1 ℃，鱼类代谢活力将提高10%。Bjorklund[22]最早证实温度升高会加快噁喹酸在虹鳟体内的吸收和排泄，林茂等[17]研究了20、24和28 ℃3种温度下氟苯尼考在鳗鲡体内的代谢动力学特征，证实高温条件下鳗鲡对氟苯尼考的吸收、消除速率均比在低温条件下快。大菱鲆属于海洋冷水性鱼类，对温度指标要求较严，最适生长温度为14～17 ℃，我国养殖大菱鲆主要采用深井海水室内工厂化模式，水温波动范围较小，但在炎热夏季也会出现水温升高情况。为此，本研究比较了14和17 ℃水温下氟苯尼考的代谢动力学特征，与14 ℃时的代谢动力学参数相比较，17 ℃时氟苯尼考静注给药后的分布相和消除相半衰期均缩短，表观分布容积增加；口灌给药后消除相半衰期缩短，表观分布容积和分布相半衰期均增加；口灌给药后的达峰时间没有明显变化，但峰浓度升高，生物利用度也升高了。这些结果表明，温度升高会促进大菱鲆对氟苯尼考的吸收、分布和消除，提高口灌生物利用效率。

3.3 氟苯尼考给药方案建议

我国大菱鲆养殖所发现的细菌性疾病多由弧菌属细菌引起，主要病原菌包括鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和大菱鲆弧菌(VibrioScophthalmi)等[23]，此外迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)也是引起大菱鲆腹水病的主要病原之一。制定抗菌素用药方案需要根据药效学(PD)和药动学(PK)研究结果进行综合考量，给药间隔期间血药物浓度必须维持超过病原菌MIC值才能起到治疗作用。研究表明，氟苯尼考对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)等海水养殖常见菌有较强抑制作用，MIC值均低于2 μg/mL[24-26]。本研究中，大菱鲆经口给药后的血药浓度在24 h时仍维持在2 μg/mL以上，可以有效抑制这些病原菌增殖，但AliAbadi & Lees等学者认为当抗菌素的PK/PD联合指标AUC/MIC≥100或Cmax/MIC>8时，才能避免由于耐药菌株产生而造成进一步的药物选择压力[27]。因此，建议应用氟苯尼考防治大菱鲆细菌性病害时提高口服剂量，并连续使用。按照徐叔云等[28]提出的公式进行估算，设定期望稳态血药浓度为10倍MIC，则14 ℃时口服剂量应为25 mg/kg BW，17 ℃时口服给药剂量应为22 mg/kg BW，每日一次，可以达到有效治疗常见细菌性疾病的目的。

4 结语

温度升高会加快大菱鲆对氟苯尼考的吸收、分布和消除，提高口灌方式氟苯尼考利用效率，据此提出氟苯尼考给药方案：14°C时，大菱鲆口灌给药剂量为25 mg/kg BW，每日一次；17°C时，大菱鲆口灌给药剂量为22 mg/kg BW，每日一次。