AM真菌对百合调节激素平衡与细胞渗透性以及改善耐盐性的研究

李文彬，宁楚涵，郭绍霞*

(1 青岛农业大学 菌根生物技术研究所，山东青岛 266109；2 青岛农业大学 园林与林学院，山东青岛 266109)

土壤盐渍化是全球性的问题，全世界盐渍土壤的面积约占陆地面积的10%，中国盐渍土面积约有0.7亿hm2，并随着生态环境的恶化和不合理地开发利用仍在进一步扩大，限制了世界上大部分干旱和半干旱地区的植被生长[1-2]。如何开发利用如此大面积的盐碱地资源，改善植物抗盐性有着重要的生态和经济价值。其中，丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌在提高植物抗逆性方面具有功能多样性[3-5]。该类真菌通过与寄主植物建立互惠共生体，不仅促进植物对营养和水分的吸收利用，还能增强植物抵抗不良环境的能力[6-7]。研究表明AM真菌通过增加植物生物量以及在盐分胁迫条件下选择性吸收养分来促进植物生长，并通过增加盐胁迫条件下的抗氧化防御机制来降低盐胁迫的不利影响，同时调节Na+、K+含量保持渗透平衡来减轻盐胁迫引起的有害效应[8-10]。兰香罗勒(Ocimumbasilicum)接种沙荒隔球囊霉(Septoglomusdeserticola)后植株茎、根干物质质量、茎高、叶面积、叶数和枝性状均显著高于未接种植株，菌根减轻了盐度对植物吸收K、P、Ca的抑制作用[11]；盐胁迫下芦笋(Asparagusofficinalis)幼苗株高、鲜重、干重均显著降低，接种摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)可以有效缓解盐胁迫对芦笋幼苗生长的抑制[12]；AM真菌+NaCl处理的芦笋幼苗地上部K+、Ca2+、Mg2+含量与未接种处理相比分别增加了58.4%、50.4%和76.0%，而Na+含量则减少了42.3%，表明接种AM真菌可以通过调节芦笋体内的离子平衡来有效缓解盐胁迫对植株的伤害；单独接种摩西斗管囊霉或与根内根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)双混合接种能有效提高温室盆栽木豆(Cajanuscajan)生物量、产量、养分吸收量和细胞膜稳定性[13]。另有研究表明，接种变形球囊霉(Glomusversiforme)可增加枸杞(Lyciumbarbarum)根和叶片中吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的含量[14]。

百合(Liliumbrownii)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)球根植物的总称。其种类繁多，花朵硕大且色彩丰富，既能作盆花和切花，又能应用于园林绿地，是花卉旅游项目中最负盛名的种类，兼具良好的药用、保健、化工等实用价值[15,16]。百合原产地中海沿岸、欧洲各地及大洋洲列岛，不耐盐碱；然而中国北方地区百合生产受到土地盐渍化的影响，限制了其在北方地区的露地栽培，而在设施条件下进行栽培需要进行土壤改良或用基质栽培。因此，迫切需要增强百合抗盐碱等特性来满足市场的需求。本试验目的是考察AM真菌提高百合耐盐性的效应，并初步分析其作用机制，以期为AM真菌在园林花卉中的应用提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试AM真菌摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和变形球囊霉(Glomusversiforme)的菌种均由青岛农业大学菌根生物技术研究所自有，由三叶草扩繁，以保存于其根系及基质中的孢子、菌丝和菌根根段为接种物(菌根侵染率为75%，孢子密度为每50 g约480个)。供试植物为东方百合品种‘西伯利亚’(购自云南省农业科学院花卉研究所)，种球周径16～18 cm。供试基质营养土由草炭和珍珠岩按照1∶3体积比混合而成，pH 6.4，有机质含量112 g/kg，全氮1.2 g/kg，全磷0.7 g/kg，全钾12.6 g/kg，碱解氮23 mg/kg，有效磷16.6 mg/kg，速效钾83.4 mg/kg。

1.2 材料培养与处理

先将百合种球于5～10 ℃冷藏处理8～16周，在种植前种球用0.05% 高锰酸钾溶液消毒30 min，用蒸馏水冲洗，晾干。种植基质为120 ℃高温蒸汽下灭菌2 h的基质，75% 酒精溶液消毒育苗容器花盆。将基质装入塑料盆(上直径20 cm、下直径13 cm、高16 cm)，每盆接种AM真菌的剂量为12 000接种势[IP=N×W×K+S，IP为接种势单位，N为单位长度根段内含有的泡囊数量，W为根重(g)，K为单位质量根系长度(cm)，S为单位质量或体积接种剂内孢子数量]，对照(CK)则接种等量灭菌接种物，以保持相同的其他根围微生物区系环境。

采用温室盆栽试验，NaCl处理设置质量分数分别为0、0.4%、0.8%、1.2%的4水平，接种处理设置接种摩西斗管囊霉(Fm)、变形球囊霉(Gv)、摩西斗管囊霉+变形球囊霉(Fm+Gv)和不接种对照(CK)，共组成16个处理组合，随机排列，每个处理组合重复8次。盐胁迫前控水数天，以利于盐水在干燥的培养土中迅速扩散。盐胁迫处理时，为避免盐冲击效应，盐浓度每天按0.3%梯度递增，直至预定浓度，然后每2～3 d按预定盐浓度(混有Hoagland营养液成分)浇灌1次，每次浇至约2/3的溶液流出，保持盐浓度的恒定，盐胁迫42 d后取样测定各生理指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1形态指标盐胁迫处理后，每天观察，以幼苗叶片出现黄叶作为盐害症状，耐盐系数为盐害症状出现前在不同浓度NaCl中生长的天数乘以百分比浓度的总和。盐胁迫后42 d分别测定株高及干重。从露出培养土的部位开始到植株最高点算为一株的株高；将植株冲洗干净，吸干表面水分，然后置105 ℃烘箱中杀青10 min，再转为80 ℃烘至恒重，称得干重。上述各指标都取15株的平均值，重复3次。

1.3.2AM真菌侵染率根据刘润进等[17]改进的根段频率估测方法测定AM真菌侵染率。

1.3.3抗逆生理指标取新鲜百合植株叶片，比色法[18]测定丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，电解质渗透法[19]测定膜透性(用相对电导率表示)，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[18]，采用比色法测定脯氨酸含量[18]。

1.3.4内源激素含量采用色谱检测法[18]测定内源激素脱落酸(abscisic acid，ABA)和吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)含量。称取0.5～1.0 g新鲜百合叶片，加2 mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4 ℃冰箱中。样品测定流程为：包被→洗板→竞争→洗板→加二抗→洗板→加底物显色→比色。

1.3.5矿质元素含量将百合植株叶片先在105 ℃下杀青15 min，后转至80 ℃烘至恒重，用粉碎机粉碎后过筛，称取0.05 g样品加入6 mL浓HNO3消化，采用消煮炉消解法处理样品，将样品定容至25 mL容量瓶后用ICP-OES-Optima 8x00电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)进行K、P、S、Na、Fe等元素含量的检测[19]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用DPS 7.5和SPSS 11.5统计分析软件对数据进行差异显著性检验(LSD法，α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同NaCl浓度下百合菌根侵染率和干重的变化

方差分析表明，接种AM真菌、NaCl胁迫及其对二者的交互作用对百合株高和生长量有极显著影响(表1)。首先，在不接种AM真菌条件下，不同盐浓度处理百合根系侵染率均为0；在单独接种或者双接种摩西斗管囊霉(Fm)和变形球囊霉(Gv)后，百合根系的菌根侵染率均随盐胁迫浓度的增加而逐渐降低；与盐浓度为0时相比较，Fm、Gv和Fm+Gv接种百合根系菌根侵染率在盐浓度为1.2%时分别显著降低了14.0、14.7和19.3个百分点(P<0.05)；在同一NaCl浓度下，双接种处理百合根系侵染率最高，接种Fm处理次之，Gv处理最低。其次，生物量和株高是衡量植物生长状况最为直接的形态指标。在同一盐浓度下，接种AM真菌可显著增加NaCl胁迫下百合株高和生长量；随NaCl浓度的增大，百合株高、地上部分干重、地下部分干重逐渐显著降低。1.2%NaCl胁迫下，双接种Fm+Gv处理的百合株高、地上部分干重、地下部分干重最高，显著高于单接种和不接种对照，并表现为Fm+Gv>Fm>Gv>CK；此时，Fm+Gv处理株高、地上干重、地下干重比CK分别增加8.9%、14.5%和11.2%，Fm处理分别增加5.0%、12.4%和7.9%，Gv处理比对照分别增加3.0%、11.8%和6.6%。可见，百合根系能与2种AM真菌均能建立良好的共生关系，双接种能显著促进侵染，盐胁迫则显著抑制了AM真菌的侵染，而双接种受到的抑制较轻；单独或者双接种处理均能有效增加百合株高和生长量，且双接种处理效果明显优于单接种效果。

2.2 不同NaCl浓度下AM真菌对百合叶片相对电导率和丙二醛含量的影响

植物叶片相对电导率以及MDA含量的变化可反映植物受逆境胁迫的损伤程度。方差分析表明AM真菌、NaCl胁迫及其二者的交互作用对百合叶片丙二醛含量和相对电导率有极显著影响(图1)。在同一盐浓度胁迫下，接种AM真菌可显著降低NaCl胁迫百合叶片MDA含量和细胞膜透性(P<0.05)，且各接种处理间存在显著性差异，接种效果表现为Fm+Gv>Fm>Gv>CK。在同一接种处理下，随NaCl浓度的增大，百合叶片MDA含量和膜透性又逐渐显著增加，且盐胁迫浓度间存在显著性差异；在1.2%NaCl胁迫下，双接种Fm+Gv处理百合叶片丙二醛和相对电导率比未接种对照CK的降低幅度最大，分别达到58.1%和9.0%，接种Fm处理分别下降9.5%和7.2%，接种Gv处理分别下降3.8%和5.2%(图1)。可见，接种AM真菌能够显著降低盐胁迫对百合叶片的膜质过氧化伤害，且双接种的效果更佳；这可能是由于接种处理增强了百合叶片抗氧化酶活性，从而减少了植株体内MDA含量并降低细胞膜膜透性，缓解叶片细胞损伤程度。

2.3 不同NaCl浓度下AM真菌对百合叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响

可溶性蛋白和脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，其含量多少能够在一定程度上反映植物受胁迫程度和抵抗逆境的能力。方差分析表明，AM真菌、NaCl胁迫以及二者的交互作用对百合叶片可溶性蛋白含量和脯氨酸含量有极显著影响。图2显示，在同一接种处理下，百合叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量随盐胁迫浓度增加均呈增加的趋势，并均在1.2%盐浓度下具有最大值，且在盐浓度间大多差异显著。在盐浓度相同时，接种AM真菌条件下盐胁迫百合叶片内可溶性蛋白含量均比未接种对照(CK)显著增加，而叶片脯氨酸含量则比CK显著降低，且双接种Fm+Gv处理植株叶片的可溶性蛋白均显著高于相应Fm和Gv处理，但其脯氨酸含量均显著低于相应Fm和Gv处理。其中，接种Fm+Gv、Fm、Gv处理的百合叶片可溶性蛋白含量在盐浓度1.2%时分别比未接种CK提高69.0%、3.8%和60.8%，其叶片脯氨酸含量分别比CK显著降低31.0%、18.6%和25.0%。可见，接种AM真菌可调节百合叶片渗透物质的含量，从而增强百合叶片细胞渗透调节能力和应对逆境的能力，且双接种的效果更佳。

表1 不同NaCl浓度下百合侵染率和生物量的变化

注 同列不同字母表示处理间差异达到5%显著水平(P<0.05)；下同

Note：Different letters within the same column indicate significant difference among treatments at 0.05；The same as below

2.4 不同NaCl浓度下AM真菌对百合叶片脱落酸和吲哚乙酸含量的影响

植物激素含量及激素平衡也会在盐胁迫下产生一些适应性变化。方差分析表明，接种AM真菌和NaCl处理以及二者互作效应对百合叶片脱落酸(ABA)和吲哚乙酸(IAA)含量均有显著影响。从图3可知，在同一接种处理下，百合叶片脱落酸(ABA)含量随盐浓度的增加而增加，吲哚乙酸(IAA)含量随盐浓度的增加而降低，且各盐浓度之间均存在显著性差异。同一盐浓度下，与未接种对照(CK)相比，各接种AM真菌处理百合叶片IAA和ABA含量均显著提高，且各接种处理间均差异显著(P<0.05)，其中的IAA含量表现为Fm+Gv>Fm>Gv>CK，而ABA含量则表现为Gv>Fm>Fm+Gv>CK，说明双接种处理能够显著增加IAA含量而减缓ABA的生成量。其中，在1.2%NaCl胁迫时，双接种Fm+Gv处理百合叶片ABA和IAA含量分别比未接种CK显著增加21.3%和53.4%，Fm处理分别比CK显著增加24.0%和11.9%，Gv处理分别显著增加46.2%和28.3%。以上结果说明，接种AM真菌能够调节盐胁迫百合叶片激素平衡，且双接种的增加效果显著优于单一接种。

图1 AM真菌对盐胁迫下百合叶片丙二醛和相对电导率的影响Fig.1 Effects of AM fungus on MDA content and relative conductive in leaves of L. brownii under salt stress

图2 AM真菌对盐胁迫下百合叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响Fig.2 Effects of AM fungus on soluble protein and proline contents in leaves of L. brownii under salt stress

2.5 不同NaCl浓度下AM真菌对百合叶片营养元素含量的影响

AM真菌能通过扩大植物根系的吸收范围，从而增加植物对营养元素的吸收。方差分析表明AM真菌、NaCl浓度及其的交互作用对百合叶片Na、P、K、S和Fe含量均有极显著影响。表2显示，在同一接种处理下，百合叶片P、K、S含量随盐浓度增加而降低，Na、Fe含量却呈现上升趋势。在盐浓度相同时，接种AM真菌可增加百合叶片P、K和S含量，且双接种Fm+Gv处理植株的含量均不同程度地高于单接种Fm和Gv处理；但接种却显著降低了叶片中Na、Fe含量，且双接种Fm+Gv处理含量低于单接种处理。其中，在盐浓度为1.2%时，Fm+Gv、Fm和Gv接种处理百合叶片的P含量分别比CK提高11.0%、5.7%、4.4%，它们的K含量分别提高8.4%、5.0%、3.4%，它们的S含量分别提高13.6%、11.1%、10.9%，其Na含量分别下降28.4%、25.3%、23.0%，而Fe含量分别大幅下降66.4%、44.2%、65.0%。以上结果表明接种AM真菌可以降低百合植株体内Na离子相对含量，促进营养元素P、K、S的吸收，从而有利于减轻盐离子毒害作用。

图3 AM真菌对盐胁迫下百合叶片脱落酸和吲哚乙酸含量的影响Fig.3 Effects of AM fungus on ABA and IAA contents in leaves of L. brownii under salt stress

接种处理Inoculation treatmentNaCl浓度NaCl concentration/%营养元素含量Nutrient elements content/(mg/kg)钠Na磷P钾K硫S铁Fe不接种对照Non-inoculation (CK)0360.4±1.6h436.3±36.6bcdef800.3±10.2c724.6±36.3a54.5±3.4de0.4540.2±21.1f408.1±28.4efgh710.4±11.1ef651.8±15.9b73.4±6.3c0.8719.3±34.2d405.4±16.3efgh630.2±12.3hi563.8±17.9cde90.7±15.4b1.21 503.5±14.2a373.0±24.1h600.0±10.4i474.4±41.6f133.9±31.2a摩西斗管囊霉F. mosseae (Fm)0311.5±48.3ij472.4±13.6ab 954.0±7.8ab745.3±51.2a39.7±4.6ef0.4455.4±16.5g430.2±15.6bcdefg748.1±9.6d717.5±41.7a43.2±3.3ef0.8610.2±17.4e425.4±23.4cdefg685.4±21.3f593.4±36.4bcd66.3±3.1cd1.21 123.4±20.3bc394.2±45.3fgh630.2±24.3hi527.2±28.9ef74.7±10.2bc变形球囊霉G. versiforme (Gv)0321.6±22.4hi470.7±33.3abc 926.5±13.3b745.5±52.3a39.2±5.4ef0.4467.3±26.3g422.0±25.1defg740.6±6.4de718.1±36.6a39.5±3.7ef0.8600.8±45.3e420.0±14.8defg690.3±17.4f580.7±41.2de40.5±2.6ef1.21 157.9±27.8b389.7±16.3gh620.5±25.3hi526.1±21.6ef46.9±3.7ef摩西斗管囊霉+变形球囊霉F. mosseae + G. versiforme(Fm+Gv)0265.0±18.6j487.2±10.8a 963.7±45.1a766.1±36.7a37.9±1.3f0.4446.7±63.1g458.8±34.2abcd760.7±32.1d726.1±33.7a39.0±2.7ef0.8551.4±29.4f441.8±17.9abcde681.2±21.0fg622.2±41.5bc42.0±4.4ef1.21 076.5±15.6c414.2±47.4defgh650.5±15.6gh538.9±24.6de45.0±3.4ef

表3 AM真菌对盐胁迫下百合耐盐系数的影响

注：-表示未出现

Note: - indicates no appearance

2.6 不同NaCl浓度下AM真菌对百合耐盐系数的影响

耐盐系数可以反映植物对盐胁迫的耐受能力，其值越高植物的耐盐能力越强。表3显示，不同浓度NaCl胁迫下百合植株盐害程度不同。其中，在0.4%盐浓度下，接种AM真菌和未接种处理的百合植株均未出现黄叶；在1.2%盐浓度下，Fm、Gv和Fm+Gv接种处理的百合叶片出现黄叶时间比对照分别推迟了8 d、7 d和11 d。盐胁迫32 d 时，未接种AM真菌CK的百合叶片开始出现萎蔫，单一接种Fm处理的百合叶片萎蔫时间比CK推迟8 d，单一接种Gv处理百合叶片萎蔫时间比CK推迟7 d；而在盐胁迫的42 d内，共同双接种Fm+Gv处理的百合叶片始终未出现萎蔫。以上结果表明接种AM真菌可以有效推迟盐胁迫下百合叶片萎蔫和黄叶出现的时间，显著提高百合的耐盐系数，且共同双接种的效果更佳。

3 讨 论

在盐胁迫环境下，植物往往受到离子毒害、渗透胁迫、养分亏缺等多方面伤害，从而导致生长发育受阻，生物量下降，在高浓度盐分下甚至会死亡[20]。本研究表明，NaCl胁迫抑制了百合植株的正常生长，使其株高、根系和地上部的干重均显著降低。有研究发现，AM真菌根外菌丝与土壤结合形成菌丝网，能够扩大根系的吸收范围，直接参与植物体内的水分代谢活动[21]，增强N、P、K等矿质元素的吸收面积和转化能力，维持细胞渗透压和抗氧化系统以及相关调控基因的表达[22-24]，进而有效地提高根系对水分和矿质元素的吸收，缓解盐分对植物生长的伤害。本试验结果表明，接种AM真菌可以促进百合植株在NaCl胁迫下的生长，这可能与其改善百合营养状况有关，以及与其增加百合根系对水分的吸收不无关系，对于后者有待试验证实。同时，本研究发现，NaCl胁迫减少了AM真菌对百合根系的侵染率，说明NaCl处理下AM真菌的菌根侵染受到一定的抑制；不同菌种对植物在逆境下的功效有所不同，本试验条件下接种摩西斗管囊霉的侵染率高于变形球囊霉，而且双接种摩西斗管囊霉和变形球囊霉处理比单一接种处理能更高效发挥对百合生长和根系侵染的促进效应。

同时，盐害能够造成植物的细胞膜系统损伤，而丙二醛是细胞膜脂化产物，其含量高低能代表膜脂过氧化的程度，从而间接反映植物组织的抗氧化能力[25]。在NaCl胁迫下，细胞原生质膜结构和功能遭到破坏，细胞膜透性变大，细胞内电解质外渗，导致组织浸出液的电导率增大[26]。本试验发现，接种AM真菌后，NaCl胁迫百合叶片的丙二醛、脯氨酸含量和相对电导率均比未接种对照(CK)显著降低，而同期可溶性蛋白含量却显著增加；在1.2%NaCl浓度下，摩西斗管囊霉和变形球囊霉共同接种的百合叶片丙二醛含量比未接种对照显著降低58%，电导率显著降低9%。说明接种AM真菌能减缓NaCl胁迫下百合叶片细胞膜过氧化程度，在一定程度上提高百合的抗盐性。

再次，植物受到盐胁迫时，土壤中过量的Na会影响植物对Na、K、P和S等元素的吸收及其在细胞内的区域化分布，导致离子稳态破坏[27-28]。本研究表明，NaCl胁迫下百合叶片内Na大量积累，P、K和S含量减少，这可能是环境Na含量过高影响了生物膜对离子的选择性，进而影响了根系对营养元素的吸收造成的。有关AM真菌减缓盐离子对植物毒害作用的机制，目前尚无定论。本试验表明接种AM真菌能显著降低盐胁迫下百合叶片中Na和Fe含量，有利于减轻盐离子毒害作用。

另外，有研究表明，植物激素有助于调节植物生长和发育，以响应外界环境压力[29]；AM真菌可以通过影响植物激素的产生而影响植物的生长，不同激素平衡可以协同调节根系构型，同时AM真菌与植物共生还可以调节ABA含量以改变根系的水力特性，在不利条件下提高吸水率[30]。因此，IAA、ABA是植物适应盐胁迫的关键。本试验结果表明，接种AM真菌能够调节百合叶片内源激素(ABA和IAA)平衡状况及其细胞渗透势，这对于维持光合作用与气孔导度，以及进一步提高耐盐性具有重要意义。

综上所述，AM真菌可以通过增强百合叶片对养分的吸收、降低氧化胁迫造成的伤害、调节植物内源激素平衡状况与细胞渗透性来增强百合耐盐性。另外，植物遭受盐害时基因表达发生变化，涉及信号转导、物质运输、光合作用、碳水化合物代谢等多个方面，其中不同AM真菌对植物耐盐基因表达的影响还需进一步探讨。