烟草NtHMA4基因突变体鉴定及低镉特性研究

高玉龙，王丙武，李文正，李梅云，宋中邦，吴玉萍

(云南省烟草农业科学研究院，烟草行业烟草生物技术育种重点实验室，国家烟草基因工程研究中心，昆明650021)

镉是常见的土壤重金属污染物之一。种植于镉污染土壤上的植物能够从土壤中吸收镉，进而对植物和人体造成伤害。近年来，随着工业快速发展，矿产资源的不合理开采等原因，镉污染问题日益严重[1]。2014年中国土壤污染状况调查公报披露，中国土壤污染物总的超标率为16.1%，污染类型以无机型为主，其中又以镉污染为主要污染类型，其点位超标率为7%，从污染分布情况来看，南方土壤污染较重，西南、中南地区土壤重金属超标范围较大[2]。当镉含量为植物叶片干重的5～10 mg/kg时，就会对植物造成伤害[3]。镉是植物生长发育的非必需元素。植物中，镉的流向主要有3个：根部吸收、根部螯合及向地上部运输。

目前，对镉从根部向地上部的运输机制研究得较为清楚。镉的转运体主要包括AtIRT1(iron-regulated transporter 1)、AtNRAMP3(natural resistance-associated macrophage)[4]、AtHMA2[5]和AtHMA4[6]等。拟南芥中AtHMA2、AtHMA4基因的研究结果表明：过量表达AtHMA4基因可提高植株对镉的耐性及吸收力[7-8]，而HMA4基因突变后则能增强植物对镉的敏感性[9]。水稻OsHMA2蛋白是水稻锌和镉从根向茎的主要转运体[10]。在拟南芥中过量表达大麦HvHMA2基因可部分恢复拟南芥双突变体hma2hma4锌和镉的转运能力[11]。可见不同植物中的HMA蛋白功能上具有保守性。

烟草(NicotianatabacumL.)是镉富集植物，且主要积累于叶片。中国各烟区烟叶中的镉含量平均为2.95 mg/kg，最高为19.35 mg/kg[12]。与其他重金属相比，镉在烟气中的迁移率较高。吸烟成为人体摄入镉的重要途径之一，因此降低烟叶中镉含量成为烟草生产及育种工作的重要目标[13]。该研究以功能研究较为清楚的植物镉转运基因HMA4为靶标，利用TILLING技术筛选‘云烟87’ EMS突变体库，获得一个该基因的错义突变体。对该突变体进行镉胁迫试验，以期获得对镉转移能力下降的烟草材料，为培育低镉含量烟草品种提供育种材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

‘云烟87’野生型种植于云南省烟草农业科学研究院试验基地，开花期取根、茎(距根部1/3处)、叶(第10位叶)、花组织液氮速冻后于-80℃保存备用。1 842份‘云烟87 ’EMS突变体由云南省烟草农业科学研究院创制并保存。利用TILLING技术从该突变体库中筛选获得NtHMA4基因发生核苷酸改变的一个突变体hma4-4h12，该突变体用于镉胁迫试验及大田农艺性状调查。

1.2 方 法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成按照试剂盒RNAiso Plus(Takara，日本)的操作说明，提取野生型‘云烟87’开花期根、茎、叶、花的总RNA。由微量紫外检测仪Nano-Drop检测RNA浓度。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，日本)将提取的RNA反转录成cDNA。

1.2.2NtHMA4基因组织特异性表达分析根据基因NtHMA4 CDS序列(NCBI登录号HF937054.1)设计qRT-PCR引物HMA4QF(GTTTCAGAATCAAAGTCATGTG)和HMA4QR(GCAGATTGGC-ATGCTTTAGA)。以烟草Actin基因作为内参，设计PCR引物Actin-F(CTGAGGTCCTTTTCCAACCA)和 Actin-R(TACCCGGGAACATGGTAGAG)。

以cDNA为模板进行荧光定量PCR，反应在Roche LightCycler 480上利用LightCycler 480 SYBR Green I master进行，20 μL体系含有 10 μL LightCycler 480 SYBR Green I master(2×)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL(反转录产物稀释4倍)，7 μL 灭菌蒸馏水。反应程序如下：95 ℃预变性 5 min；95 ℃退火 20 s，61 ℃变性 15 s，72 ℃延伸15 s，45个循环。反应结束后对扩增产物荧光值变化和溶解曲线进行分析。相对表达量使用2-ΔΔCt方法，3个生物学重复。

1.2.3TILLING筛选NtHMA4基因突变体利用Primer 3设计TILLING引物，T-HMA4-F(TAG-AGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG)和T-HMA4-R(ATAAGCTGAGAGCTTAAGAAAAAA-GAAACT)。利用DNeasy Plant Mini Kit提取突变体库中1 842份M2代材料叶片的DNA。将所有样品的DNA浓度稀释至40 ng/μL，组建成8倍样品池用于TILLING检测。TILLING检测步骤具体参照文献[14]。筛选的突变体M3代通过测序进行验证，最终获得纯合突变体hma4-4h12。

1.2.4突变体镉胁迫试验将突变体hma4-4h12及对照‘云烟87’种植于温室，昼/夜温度为(25±1)℃/(20±1)℃。盆栽试验使用28 cm×28 cm塑料盆，盆栽介质为烟草育苗基质∶沙=1∶1。每株施烟草专用肥(N∶P∶K=1∶1.5∶2.8)30 g，分5次施入，突变体和对照种植各20株，各取9株长势一致的烟苗进行试验。现蕾期[15]将500 mL CdCl2溶液(100 μmol/L)浇于烟株根部，5 d后取第17～19片叶[16-17]，去梗后100 ℃杀青，60 ℃烘干备用。

1.2.5重金属含量的检测根据烟草行业标准YC/T380-2010[18]，利用电感耦合等离子体质谱仪测定烟叶中镉、砷、铅、铬、镍的含量。样品粉碎后过100目筛，称取0.2～0.3 g样品于消解罐中，样品精确到0.1 mg。向消解罐中依次加入5 mL 65%浓硝酸和2 mL 30%过氧化氢，旋紧消解罐盖子，置于微波消解仪中。消解程序：室温经5 min升至100 ℃，保持5 min；再经5 min升至130 ℃，保持5 min；最后经10 min升至190 ℃，保持20 min。消解完毕后，待温度降至室温后取出消解罐。将消解罐中的样品溶液转移至50 mL塑料容量瓶中，用去离子水冲洗消解罐3～4次，将清洗液一并转移至容量瓶中，用去离子水定容，摇匀后将所得的样品溶液进行检测。锌、铜、铁、锰的检测前处理同上，不同的是消解后的样品上电感耦合等离子体光谱仪进行检测。

1.2.6大田农艺性状调查试验在云南省烟草农业科学研究院玉溪市研和试验基地进行，种植密度为120 cm×50 cm。使用烟草专用肥，N∶P∶K=1∶1.5∶2.8，施肥量按75 kg/hm2进行，底肥占总施肥量的30%，追肥分5次施入，占70%。在中心花开放时打顶。农艺性状参照中国烟草行业标准YC/T 142-2010[19]进行调查。采用完全随机区组设计进行试验，突变体hma4-4h12和对照‘云烟87’分别设5个小区，每个小区种植50株。在每个小区中选择5株具有代表性的烟株进行农艺性状调查。

2 结果与分析

2.1 NtHMA4基因组织特异性表达分析

拟南芥、水稻等作物[20-21]中HMA4基因主要在根中表达。对烟草不同组织中NtHMA4基因的表达研究结果(图1)显示，该基因在烟草根中表达量最高，茎和花中微量表达，叶中基本不表达。该基因的表达模式与其编码蛋白功能有关，重金属Cd或Zn等在根部与HMA4蛋白结合并运往地上部。

2.2 NtHMA4基因突变体的获得

HMA4是植物二价重金属镉、锌从地下部向地上部转运的主要转运体。烟草NtHMA4基因ORF长4 335 bp，编码1 444个氨基酸。利用TILLING技术从1 842份‘云烟87’ EMS突变体库中获得1个NtHMA4基因错义突变体，其核苷酸突变方式为C152T，氨基酸突变方式为T51I，命名为hma-4h12。突变体突变位点在NtHMA4基因组中的示意图见图2。该突变体突变位点位于NtHMA4基因5′端，突变体中第51位氨基酸由极性氨基酸苏氨酸变为非极性的异亮氨酸，该突变可能对蛋白的三维结构产生影响。通过测序获得了纯合突变株系(图3)。

图1 NtHMA4基因组织特异性表达分析Fig.1 Analysis of tissue specific expression of NtHMA4

方框所示为突变位点图3 hma4-4h12纯合突变体测序结果box is shown as a mutation siteFig.3 Identification of homozygous mutation site by sequencing

图2 突变体hma4-4h12中NtHMA4基因突变位点示意图Fig.2 Diagram of mutation site of hma4-4h12 in NtHMA4 gene

2.3 突变体镉胁迫试验

温室种植突变位点纯合的突变体hma4-4h12。现蕾期在烟株根部施入500 mL 100 μmol/L CdCl2，处理后5 d取中部叶片杀青、烘干后检测重金属含量。与对照相比(图4)，突变体hma4-4h12叶片中的镉、锌、砷含量分别降低55.48%、21.11%、27.50%，差异均达到极显著水平；铜、铅、镍含量分别降低20.96%、16.23%、19.28%，差异达到显著水平；突变体铁、锰和铬含量与对照没有显著差异。这些重金属中，镉、铬、铅和砷不参与植物的生理过程，而锌、铁、锰、铜和镍或参与植物氧化还原反应，或作为酶、其他蛋白的辅酶因子、配位基团。

2.4 突变体农艺性状

由于hma4-4h12是EMS诱变获得的，除了目标基因突变外，可能还有许多未知位点的突变，这些突变可能会影响到hma4-4h12的表型，为了研究该突变体大田农艺性状是否有明显的缺陷，在大田种植该突变体对农艺性状进行了观察比较。结果表明(图5)，突变体hma4-4h12自然株高、打顶株高与对照相比变矮，且差异达极显著水平；茎围、节距、最大腰叶长与对照相比变小，且差异达极显著水平；hma4-4h12自然叶数与对照相比变少，其差异达显著水平。可见突变体hma4-4h12与对照相比在农艺性状上具有较大差异。该突变体在生产上进行应用还需要对缺陷性状进行回交改良。

*和**分别表示0.05和0.01水平上差异显著。下同图4 突变体重金属含量*and * indicate significant difference at 0.05 level and 0.01 level，respectively. The same as belowFig.4 Content of heavy metal in mutant tobacco leaf

3 讨 论

随着工业化进程的加速，重金属镉污染日趋严重。镉通过食物最终被人体吸收，可以对人体造成重大伤害。烟草是中国重要的经济作物，在国民经济中占有举足轻重的地位。烟草对镉的富集作用较大，降低烟草镉含量是当前烟草减害的一个重要目标。HMA4是植物镉转运的主要蛋白之一，主要负责镉从根部向地上部的转运[5-7,10]。拟南芥AtHMA4基因突变后可显著降低镉从根部向地上部的转运率[5]。烟草以叶片为收获对象，通过抑制镉从根部向地上部的转运而获得烟叶镉含量降低的烟草品种是一个有效的途径。

本研究获得了一个烟草镉转运基因NtHMA4的EMS突变体hma4-4h12，该突变体第51位氨基酸由极性氨基酸苏氨酸变为非极性的异亮氨酸。通过镉胁迫试验发现，突变体hma4-4h12叶片中的镉含量比对照降低55.48%。另外，锌、铜、砷、铅、镍也降低明显。而铁、锰和铬含量与对照没有显著差异。重金属中，镉、铬、铅和砷不参与植物的生理过程，而锌、铁、锰、铜和镍或参与植物氧化还原反应，或作为酶、其他蛋白的辅酶因子、配位基团。如，铁参与叶绿体和线粒体中的电子传递过程、抗氧化胁迫、氮的固定、激素合成等过程。锰是SOD、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等的辅酶因子[22]；锌做为辅酶因子在电子传递和抗氧化代谢中起重要作用，也是许多转录因子的组成部分[23]。hma4-4h12突变体同时降低了镉、铅、砷等3种植物生长不需要的有害重金属，在低重金属含量培育中可以广泛应用。

图5 突变体大田农艺性状Fig.5 Field agronomic traits of mutant

hma4-4h12是由EMS突变体库中筛选获得的，除了目标位点外，可能还有许多突变会影响其表型等。大田种植突变体，对其表型性状进行了观察比较。突变体hma4-4h12与对照相比株高、节距、茎围等显著变小。可见hma4-4h12中含有影响这些性状的突变位点。为了利用hma4-4h12培育低镉烟草品种，后续还需要通过回交去除这些不利突变的影响。