西伯利亚白刺质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NsSOS1的分离及表达分析

耿 新，楼 静，鄂一岚，铁 英，马颖聪，林晓飞*

(1 内蒙古大学 生命科学学院，牧草与特色作物生物技术教育部重点实验室，呼和浩特010021；2 内蒙古和盛生态研究院有限公司，呼和浩特011517；3 呼和浩特市园林科学研究所，呼和浩特010030)

土壤盐渍化是影响植物生长发育的主要因素，它严重限制了农林作物的产量和种植范围。盐碱地中含有高浓度的Na+，会造成植物的生理干旱，阻断K+和其他矿物元素的吸收，导致渗透胁迫和离子毒害，损害细胞的新陈代谢和光合作用，影响植物的生长发育[1]。盐生植物能够在高盐碱环境中生存，涉及复杂的细胞代谢和生理生化过程，其中离子转运蛋白发挥了至关重要的作用。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)将细胞质中的Na+逆浓度梯度运输到液泡中区隔化集中；细胞质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)能够将细胞质中的Na+逆向运送到细胞外的高Na+环境中。此外，控制将Na+吸收到根木质部导管和调节Na+运输到芽的转运系统，也是耐盐性的决定因素[2]。

自1976年在大麦(Hordeumvulgare)[3]中首次发现质膜Na+/H+逆向转运蛋白活性以来，人们对SOS1进行了深入的研究，先后分离鉴定了拟南芥、蓝藻、盐芥[4-6]等多种甜土植物和盐生植物的SOS1基因，并对其基因结构、表达特性、功能和作用机制进行了深入研究。研究证实，SOS1蛋白利用由质膜H+-ATP酶或H+-PPiase生成的质子电化学梯度驱动Na+转运出细胞，参与植物根部Na+外排[7]，从而提高植物的耐盐性。大多数植物SOS1基因的开放阅读框含有3 410～3 500个核苷酸，编码一个含有1 129～1 169个氨基酸、分子量约为127 kD的多肽[8]。SOS1蛋白C末端包含一个占整个编码区序列60%的亲水性长尾巴(约700个氨基酸)，是调控SOS1基因活性的区域，包含多个蛋白激酶结合位点和自抑制结构域，这个自抑制结构域是SOS2磷酸化的靶位点[9-12]；N端具有高度保守的疏水性区域，并且具有10～12个跨膜结构域，可调控Na+转运速率[13]。单子叶与双子叶植物的SOS1蛋白具有较大的差异，可能是由于它们在进化历程中存在某种分异性[14]。

在盐胁迫条件下，拟南芥SOS1基因的突变体(sos1-1、sos1-2、sos1-3和sos1-4)均表现出更强的盐敏感性，并且体内积累更多的Na+[4]。在拟南芥sos1-1突变体中超表达大豆GmsSOS1，转基因植株的种子萌发率和幼苗生长状况均优于野生型和突变体植株，表明SOS1基因表达能够提高转基因植物的耐盐性[15]。在100 mmol/L NaCl条件下，超表达马齿苋(Sesuviumportulacastrum)SpSOS1的转基因拟南芥与野生型相比，具有更多的生物量、根长和侧根数，说明SOS1在植物抵御盐害的过程中发挥至关重要的作用[16]。

白刺是蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属的一种落叶小灌木，为盐生植物，主要分布在中国北部至西北部的内蒙古、宁夏、甘肃、青海和新疆等地，是干旱盐碱地带的建群种之一。内蒙古地区主要有4个种，即西伯利亚白刺(N.sibiricaPall)、唐古特白刺(N.tangutorumBobr)、泡泡刺(N.sphaerocarpaMaxim.)和齿叶白刺(N.roborowskiiKom)，其中西伯利亚白刺表现出更强的耐盐能力[17]。西伯利亚白刺在自然生境中受到盐、碱、旱的三重胁迫，导致其具有较强的耐盐碱和耐干旱能力，蕴含着丰富的抗逆基因资源。因此，研究其耐盐机理，鉴定耐盐相关基因并应用于牧草、农林作物的耐盐性遗传改良，具有十分重要的意义。本研究采用同源克隆技术克隆了西伯利亚白刺质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NsSOS1，并对其编码的蛋白结构和表达特性进行了分析，以期为今后深入解析白刺的耐盐分子机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料与试剂

植物材料为西伯利亚白刺无菌组培苗，培养基：1/2 MS + 0.5 mg/L IBA + 26 g/L Sucrose + 50 mmol/L NaCl + 0.7% Agar，培养条件：温度为(25±2)℃，光照强度为36～40 μmol·m-2·s-1，光照时间为14 h·d-1[18]。截取2～3 cm西伯利亚白刺顶芽，扦插到培养基中，生长40 d后用于提取总RNA。

1.2 实验方法

1.2.1NsSOS1基因cDNA的克隆根据GenBank上登录的唐古特白刺SOS1 cDNA序列(KC292267)，在其开放阅读框的上下游设计引物NtSOS1-F(5′-AGTGTGTCCAAGTCAACTGTAA-3′)和NtSOS1-R(5′-CAGATTGTCACCGACTGTTT-3′)。使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[宝生物工程(大连)有限公司]提取西伯利亚白刺茎叶部分的总RNA，并采用TransScript®First-Strand cDNA Synthesis Super Mix Kit(北京全式金生物技术有限公司)进行cDNA第一链的合成。以所合成的cDNA为模板，利用NtSOS1-F和NtSOS1-R引物扩增NsSOS1 cDNA序列。PCR反应体系为：1 μL(50 ng)cDNA、2.5 μL 10×TransStart TopTaqBuffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1 μL NtSOS1-F(10 μmol/L)、1 μL NtSOS1-R(10 μmol/L)、0.5 μLTransStartTopTaqDNA聚合酶(5 U·L-1)、17 μL ddH2O。反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35 cycles；72 ℃ 10 min。目的产物与pEasy-T1(北京全式金生物技术有限公司)连接并转化大肠杆菌T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含氨苄青霉素(100 mg·L-1)的LB固体培养基上筛选阳性重组菌，经菌落PCR鉴定后送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.2生物信息学分析利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件预测NsSOS1蛋白质的理论分子量和等电点；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在线软件分析NsSOS1蛋白的亲疏水性；通过TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)分析NsSOS1蛋白的跨膜结构域；使用Conserved Domain Search Service在线软件分析NsSOS1的功能结构域；使用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu. dk/services/ SignalP/)分析NsSOS1 蛋白的信号肽；使用DNAMAN进行同源性分析；利用CLUSTALW进行多重序列比对，并通过邻接法(Neighbor joining，N-J法)使用MEGA7软件绘制系统进化树。

1.2.3NsSOS1的表达特性分析将扦插后培养40 d的组培苗移入含有1/2 MS液体培养基的玻璃试管中，每隔2 d更换1次培养液，预培养7 d后进行胁迫处理：(1)移入含0、50、100、200、300、400 mmol/L NaCl 1/2 MS培养液中进行盐胁迫处理6 h；(2)移入含15% PEG(模拟干旱胁迫)、160 μmol/L赤霉素(GA)和100 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)1/2 MS培养液中处理6 h；(3)移入4 ℃培养箱中低温培养24 h。胁迫处理后提取根部和地上部的RNA，利用Real-time PCR技术调查不同胁迫因子对NsSOS1表达量的影响。

利用西伯利亚白刺actin基因(AB617805)为内参，引物actin-F(5′-GAAGAAGTATGGAGGCAGG-GTTT-3′)和actin-R(5′-GATGACACACAAGGCAA-GGAAG-3′)，扩增产物大小为160 bp，Tm为62 ℃。根据NsSOS1序列设计引物NsSOS1(Q)-F(5′-TTTAGCAAGTCGGCTGGGCAA-3′)，NsSOS1(Q)-R(5′-CCTGGCGAAATGAGAGCGTGC-3′)，扩增产物大小为157 bp，Tm为62 ℃。按照TaKaRa公司的SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ说明书，在Cycle Light 4800仪器上进行实时荧光定量PCR。反应体系：1 μL cDNA，10 μL SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ，正、反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)，加水补至20 μL，40个循环。采用2-ΔΔCT方法计算NsSOS1的相对表达量。实验设置3次重复，实验数据使用SPSS19.0软件进行统计学分析并由Excel 2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 NsSOS1基因的克隆

利用唐古特白刺NtSOS1的特异性引物NtSOS1-F和NtSOS1-R，以西伯利亚白刺的cDNA为模板，通过PCR扩增得到3 817 bp的基因片段(图1)。Blast X分析发现，得到的序列与其他植物的质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因具有较高的相似性，其与唐古特白刺NtSOS1基因序列一致性高达98%。可初步确定其为西伯利亚白刺的SOS1基因。

2.2 NsSOS1基因的序列分析

NsSOS1基因的开放阅读框为3 516 bp，编码1 171个氨基酸，蛋白质的理论分子量为128.34 kD，等电点为6.25。利用ProtScale在线分析软件对NsSOS1基因所编码蛋白质的亲疏水性进行分析结果显示，NsSOS1的N端具有高度保守的疏水性区域，C末端有一个亲水性的“尾巴”(图2，A)。利用TMHMM软件进行跨膜结构域预测结果显示，NsSOS1蛋白具有12个跨膜结构域(图2，B)。Conserved Domain Search Service在线分析结果显示，NsSOS1蛋白具有NhaP(NhaP-type Na+/H+or K+/H+antiporter)、Na H Exchanger(Sodium/hydrogen exchanger family)、cNMP_binding(Cyclic nucleotide-binding domain)、Crp(cAMP-binding domain of CRP or a regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinases)和PRK05326(Potassium/proton antiporter)等保守结构性区域(图2，C)，说明其属于Na+/H+逆向转运蛋白家族，是阳离子逆向转运蛋白(cation/proton antiporter 1，CPA1)家族中的一个亚类。根据SignalP 4.1 Server在线软件预测的结果推测，NsSOS1蛋白中不存在信号肽，说明该蛋白在细胞质合成后不能被转运出细胞，为非分泌型蛋白。

M. 200 bp DNA ladder；1. PCR产物图1 NsSOS1基因的扩增M. 200 bp DNA ladder; 1. PCR productFig.1 Amplification of NsSOS1

同源分析结果显示，NsSOS1的氨基酸序列与唐古特白刺、木榄(B.gymnorhiza)、胡杨(P.euphratica)、海滨锦葵(K.virginica)和拟南芥(A.thaliana)的SOS1氨基酸序列一致性分别为98%、69%、70%、70%和60%(图3)，说明NsSOS1蛋白具有较高的保守性。

基于20个物种的21个Na+/H+逆向转运蛋白序列，使用MEGA7软件绘制系统进化树。结果显示，植物Na+/H+逆向转运蛋白在进化上主要分为两大分支，即质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1和液泡型Na+/H+逆向转运蛋白NHX1。西伯利亚白刺NsSOS1和唐古特白刺NtSOS1与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白处于同一次级分化群；它们与锦葵科海滨锦葵KvSOS1亲缘关系最接近(图4)。

2.3 NsSOS1的表达特性分析

分别提取西伯利亚白刺组培苗根、茎、叶的RNA，利用Real-time PCR分析NsSOS1表达模式。结果如图5，A所示，在正常生长条件下，NsSOS1在西伯利亚白刺的根、茎、叶中均表达，在叶和根中的表达量较高，而在茎中表达量最低；表明NsSOS1的表达可能具有组织特异性。

为研究非生物胁迫和激素对NsSOS1基因表达量的影响，将西伯利亚白刺组培苗经NaCl、低温、干旱、外源MeJA和GA处理后，提取根和地上部分茎叶组织的RNA，利用Real-time PCR分析NsSOS1表达量的变化。结果如图5，B所示，经NaCl、低温和MeJA处理后，根部组织中NsSOS1的表达量显著提高(P<0.05)，分别上升了34.9%、92.8%和35.6%；而经干旱和GA处理后，根部组织中NsSOS1的表达量显著下降(P<0.05)，分别降低了35.2%和39.8%。经NaCl、低温、干旱、MeJA和GA处理后，地上部茎叶组织中NsSOS1的表达量均显著提高(P<0.05)，分别上升了100.3%、114.3%、102.8%、77.1%和98.8%(图5，B)。以上结果表明，NsSOS1的表达受到非生物胁迫(NaCl、低温、干旱)和外源激素(MeJA和GA)的调控。

A.亲水性/疏水性分析；B.蛋白跨膜结构域预测；C.NsSOS1蛋白的保守性区域预测图2 NsSOS1的生物信息学分析A. Hydrophilic/hydrophobicity; B. The transmembrane domain; C. Conserved domainsFig.2 Bio-informatics analysis of NsSOS1

NsSOS1：西伯利亚白刺；NtSOS1：唐古特白刺；BgSOS1：木榄；PeSOS1：胡杨；KvSOS1：海滨锦葵；AtSOS1：拟南芥；划线区域表示NsSOS1的跨膜结构M1～M12，自抑制结构域和磷酸化结构域图3 西伯利亚白刺NsSOS1与其他植物SOS1氨基酸序列的多重比对NsSOS1: N. sibirica; NtSOS1: N. tangutorum; BgSOS1: B. gymnorhiza; PeSOS1: P. euphratica; KvSOS1: K. virginica; AtSOS1: A. thaliana; The lineation regions indicate the transmembrane domains M1-M12, auto-inhibitory motifs and phosphorylation domain of NsSOS1Fig.3 Alignment of SOS1 amino acid sequences from N. sibirica (NsSOS1) and other plants

为深入分析盐胁迫对白刺NsSOS1表达的影响，将西伯利亚白刺组培苗分别在含不同浓度NaCl(50、100、200、300、400 mmol/L)的1/2 MS液体培养基中处理6 h，利用Real-time PCR分析根和地上组织中NsSOS1表达量的变化。如图5，C所示，在50、100、200、300及400 mmol/L NaCl胁迫下，根中NsSOS1表达量分别是对照组的1.14、1.28、1.35、1.19和1.25倍：根中NsSOS1表达量随着NaCl浓度的增加而升高，在200 mmol/L处理条件下达到峰值，且显著高于对照组(P<0.05)；而后随NaCl浓度的增加NsSOS1表达量开始下降，在400 mmol/L条件下出现小幅上升。在50、100、200、300及400 mmol/L NaCl胁迫下，地上部NsSOS1表达量分别是对照组的2.56、2.20、2.00、1.55和1.76倍：地上组织中NsSOS1表达量在盐胁迫条件下显著高于对照(P<0.05)，在50 mmol/L条件下达到峰值，然后随NaCl浓度的不断增加NsSOS1的表达量开始下降，同样在400 mmol/L条件下出现小幅上升。在0、50、100、200、300及400 mmol/L NaCl胁迫下，地上部NsSOS1的表达量分别是根中的1.06、2.38、1.82、1.60、1.37和1.50倍，均高于根中NsSOS1的表达量(图5，C)。

标尺代表遗传距离图4 由邻位相接法绘制的20种植物21个Na+/H+逆向转运蛋白系统进化树The scale represents the genetic distanceFig.4 Phylogenetic tree generated from 21 Na+/H+ antiporters of 20 plants using neighbor-joining method

图中标记的不同小写字母分别代表显著性差异A.根、茎、叶中NsSOS1的表达量；B.不同胁迫处理下根和地上部NsSOS1的表达量；C.不同浓度NaCl处理下根和地上部NsSOS1的表达量图5 NsSOS1基因的表达分析Different letters indicate significant differencesA. Expression levels of NsSOS1 in root, stem and leaf of N. sibirica; B. Expression of NsSOS1 gene in root and shoot of N. sibirica under different stress conditions; C. Expression of NsSOS1 gene in root and shoot of N. sibirica under different concentrations of NaClFig.5 Expression analysis of NsSOS1 gene

3 讨 论

植物根部是直接接触土壤中Na+的器官，因此根部的Na+外排和地上部分细胞对Na+的区隔化集中是决定植物耐盐性的重要机制。此外，一些盐生植物进化出了独特的形态和生理代谢机制来适应高盐环境，如盐腺、气胞、肉质化和盐诱导的兼性代谢[19]。白刺属植物的茎叶具有厚的角质层，叶片被蜡质表皮毛、气孔内陷、栅栏组织和维管束发达、细胞内含物填充蜡质晶体，这些典型的旱生植物结构特征使其在抵御盐害中发挥作用[20]。盐胁迫条件下较强的膜保护能力和膜修复能力，以及高效的胞内离子区隔化和渗透调节物质的积累能力赋予白刺属植物较强的耐盐性[20-21]。张建秋等[22]发现，白刺的盐碱胁迫相关基因与目前已知的植物耐盐基因存在较大差异，预示着白刺可能存在较为特殊的耐盐碱机理。

本研究克隆得到的西伯利亚白刺NsSOS1基因开放阅读框，比唐古特白刺NtSOS1[21]多24个核苷酸(3 251～3 274 bp)，另有63个不同的核苷酸；氨基酸序列比较分析发现，NsSOS1比NtSOS1多8个氨基酸(1 084～1 091 aa)，另有22个不同的氨基酸。跨膜结构域分析结果显示NsSOS1的N端包含12个跨膜结构域，与已知的SOS1蛋白具有10～13个跨膜区域相吻合[23]。SOS1蛋白N端高度保守的疏水性区域，特别是其含有的10～12个跨膜结构域，可调控Na+转运速率[13]。唐古特白刺NtSOS1虽与NsSOS1具有较高的序列相似性，但其N端仅有10个跨膜结构域(无57～76 aa和96～115 aa，其余跨膜结构域与NsSOS1蛋白相同)。NsSOS1和NtSOS1蛋白N端结构的差异及跨膜结构域数量的不同可能会导致它们转运Na+速率的存在差异。已有研究显示，西伯利亚白刺比唐古特白刺具有更强的耐盐性[17]，这或许是得益于NsSOS1更高效的Na+转运活性。NsSOS1蛋白具有亲水性C末端，符合shi等预测的SOS1的分子结构[24]，而且NsSOS1的C端具有与拟南芥AtSOS1类似的自抑制结构域和磷酸化位点[25]，说明西伯利亚白刺与拟南芥的SOS信号通路具有相似的调控机制。周峰等研究48种植物的61个SOS1蛋白的系统进化关系发现，SOS1在进化上被分为三个分支，即双子叶植物分支(主要包括十字花科、豆科、茄科和藜科等植物)、单子叶植物分支(主要包括禾本科植物)和苔藓植物分支[26]。系统进化分析显示NsSOS1属于阳离子逆向转运蛋白家族的中的SOS1双子叶植物分支。

SOS1基因的表达模式因植物物种的不同而表现出较大的差别。花生AhSOS1在花生的根、茎、叶和花中均有表达，但是在生殖器官(花)中表达量最高[27]；星星草PtSOS1受盐胁迫诱导而上调[28]；唐古特白刺NtSOS1基因的表达受盐、干旱、低温及高温的诱导[21]。NsSOS1基因的表达特性分析发现，经低温、干旱、MeJA、GA及NaCl处理后，NsSOS1基因在植株根部和地上部的表达均有不同程度的上升，但经干旱和GA胁迫处理后NsSOS1基因在根中的相对表达量发生明显下降，表明干旱和GA胁迫抑制了NsSOS1在根中的表达。以上研究结果说明，NsSOS1基因不仅在白刺的耐盐机制中发挥重要作用，而且参与多种抗性机制和代谢途径的调控。不同浓度的NaCl处理条件下NsSOS1在叶中的表达量显著大于根，显示地上部NsSOS1对于盐胁迫更为敏感，其能够感知环境中微弱的变化并迅速做出反应。该结果亦说明，高盐胁迫条件下西伯利亚白刺叶片中NsSOS1介导的Na+外排对于减轻细胞的离子毒害，维持细胞的正常代谢发挥关键作用。黄坤勇等[29]研究发现，黄花草木樨MoSOS1基因的表达受不同浓度盐胁迫的诱导，而且根中表达量大于地上部，该结果与本研究中NsSOS1基因表达量的分析结果不同。

截止目前，所开发及应用的Na+/H+逆向转运蛋白基因大多来自于拟南芥[4]、番茄[30]、大豆[15]等甜土植物，而开发盐生植物、特别是对盐生木本植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的研究较为匮乏。已有研究发现，甜土植物水稻和盐生植物盐芥具有相似的SOS信号通路[31]，表明高等植物可能共用一套耐盐调控机制。盐芥ThSOS1的表达量约为拟南芥AtSOS1的8～10倍，而且超表达ThSOS1的酵母比超表达AtSOS1酵母表现出更好的长势，说明盐生植物的SOS1可能具有更强的转运活性[31]。木本植物在生态系统中所发挥的作用是草本植物无法替代的，研究盐生木本植物的耐盐机理有利于利用其改造内陆荒漠和沿海滩涂盐碱地。因此，开发利用盐生植物、特别是盐生木本植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因具有十分重要的意义。在本实验室的前期研究中，通过同源克隆技术获得西伯利亚白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NsNHX1)，并且通过遗传转化研究证实，超表达NsNHX1转基因拟南芥比野生型具有更强的耐盐性[32]。近期有研究表明，在NaCl含量大于200 mmol/L培养基中超表达AtSOS1或AtNHX1的拟南芥无法生长，但同时超表达AtSOS1和AtNHX1的拟南芥可在250 mmol/L NaCl培养基中生长[33]，可能是由于质膜和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因之间协同作用减轻了细胞的离子毒害，并且激活了其他与耐盐相关功能基因，从而显著地提高了双重转化植株的耐盐性。因此将NsSOS1和NsNHX1同时在植物中超表达，获得具有更强耐盐性的转基因植株十分值得期待。本研究结果为将NsSOS1基因应用于牧草、农林作物的耐盐性遗传改良提供了理论和实验依据。