开口箭基因组中微卫星特征分析与分子标记开发

丁家玺，周天华，王小童

(陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)

开口箭(TupistrachinensisBaker)为百合科，开口箭属植物，别名竹根七、岩七[1]。主要分布于中国南方，如湖北、湖南、福建、江西、浙江、河南、安徽、陕西秦岭以南和四川等地，生林下荫湿处、溪边或路旁，海拔1 000～2 000 m。该属植物具有祛风除湿、清热解毒、散淤止痛等疗效是一种稀缺的中草药，服用时主要以根茎或者全株入药，对于跌打损伤、咽喉肿痛、风湿痹痛、痈肿疮毒、蛇毒狂犬咬伤等症状有很好的治疗效果。开口箭因其具有重要的药用价值，目前已经得到广泛关注，但随着生境的破环与野生资源的过度采挖，野生开口箭数量已经急剧减少，野生种质资源枯竭。因从有必要对开口箭的遗传背景做深入研究，分析其遗传多样性，揭示进化潜能和致濒机理，提出保护策略，为这种珍稀濒危植物的保护提供理论支撑。

物种或居群的遗传多样性是长期进化的产物，是其生存适应和发展进化的前提，是保护生物学研究的核心之一，对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定有赖于对物种遗传多样性的认识。保护遗传学的主要研究目标是保护物种遗传多样性和保持物种进化潜力，居群遗传结构、遗传变异、基因流和进化显著单元(Evolutionary Significant Unit，ESU)的确定是其主要研究内容。其中，居群遗传结构和进化显著单元的研究将直接影响遗传多样性的保护和进化潜力的保持以及保护对策的制定和实施。居群遗传结构是描述种内遗传变异在时间和空间上的分布式样，是探讨物种进化机制和保护生物学的基础。种下水平的遗传变异对于了解濒危植物在未来环境下的适应和进化，以及物种保护具有重要意义。

微卫星，也称为简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)，是由1～6 bp重复单元串联而成一段DNA，广泛分布于基因组中[2]。与ISSR、RFLP等其他标记相比，具有多态性更丰富、可提供完整遗传信息、使用方便等优点，应用于植物种质鉴定、分子标记连锁图谱构建和群体遗传学等诸多领域。目前SSR技术已经广泛应用于药用植物的遗传多样性，品种鉴定以及分子育种等研究中[3]。鉴于目前开口箭的资源现状，开发开口箭的SSR分子标记可用于开口箭的遗传多样性分析与种质资源鉴定，为开口箭的保护与资源合理利用提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所利用的开口箭材料采集于陕西省略阳县寒风山。用于微卫星通用性检测的材料(长柱开口箭、弯蕊开口箭、剑叶开口箭、筒花开口箭、吉祥草和万年青)，分别采集于湖北省竹溪、陕西省洋县、云南省昆明、陕西省汉中(表1)。

1.2 方 法

1.2.1开口箭DNA提取采用改良2×CTAB法提取开口箭1个自然居群24个样本的基因组DNA，溶解在100 μL 0.1%TE缓冲液中，0 ℃保存备用。应用紫外分光光度计(NanoDrop 2000)检测其纯度，记录DNA浓度和A260/A280吸光比值。各取10 μL 基因组DNA用浓度为1%琼脂糖凝胶检测其完整性。

表1 开口箭采样基本数据

1.2.2开口箭微卫星文库的建立与特征分析提取开口箭全基因组DNA，构建开口箭基因组文库。二代测序建库工作由北京NOVOGENE生物科技公司代理完成。

采用CLC Genomics Workbench软件[4]。进行片段组装，设置过滤参数：片段长度大于249 bp，序列平均覆盖率为25倍，初步筛选出适合微卫星位点开发的潜在序列集合。基于筛选出的序列，导出一致性序列，以fasta格式保存为单一文件。利用微卫星序列查找软件MISA软件(MIcro-Satellite indentification tool，MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对返回的开口箭基因组序列进行筛选，查找标准为：单核苷酸至少为10次重复，二核苷酸至少6次重复，三核苷与四核苷酸至少5次重复，五核苷酸与六核苷酸重复4次，混合微卫星中2个SSR距离小于100 bp。通过软件统计得到微卫星片段总数以及各个重复类型的数量，利用Excel 2016对所得数据进行统计分析。

1.2.3开口箭SSR引物开发和PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用Batchprimer3(https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/)对重复次数较高的100条开口箭微卫星序列设计引物对。采用Oligo 7对所设计的100条引物进行评估，选取综合评分在95以上的52对引物送往北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行合成。

利用上述的52对引物对开口箭的所有样本进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为20 μL，包括DNA模板50 ng，2×Mix(天根生物科技)10 μL，正反引物各50 ng，加ddH2O至20 μL。PCR反应在PCR扩增仪(Bio-Rad S1000TM)上按以下程序运行：首先94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火温度下45 s，72 ℃下延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

完成PCR循环48 h内，取2 μL PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压160 V电泳14 h。用NaOH银染方法进行染色显影。显影完成之后，用凝胶成像系统(Bio-Rad GEL DOCTM XR+)采集图像并进行数据统计分析。

1.2.4数据统计与软件分析使用Excel 2016和Bio-rad quantity软件对电泳图进行条带统计，采用人工读带的方式，记录主要带型，忽略弱杂带。应用Powermarker 3.25[5]软件，计算各引物的等位基因数目(Na)，期望杂合度(He)，观测杂合度(Ho)，多态性信息含量(PIC)等。

2 结果与分析

2.1 开口箭基因组序列的微卫星组成与特征分析

利用2×CTAB法提取的开口箭DNA效果良好，A260/A280吸光比值在1.6～1.9之间，其浓度在45～475之间。琼脂糖凝胶电泳结果表明，提取到长度大于20 000 bp DNA。结果表明，2×CTAB 提取到的开口箭的总DNA纯度高，完整度好，能用于后续的基因组测序和PCR扩增。

通过对开口箭基因组测序拼接得到23 362条基因序列，利用MISA软件对这些序列进行微卫星查找与统计分析。结果表明，在其中1 215条序列中共发现微卫星片段1 465个，含有微卫星的片段占总序列数的5.20%。微卫星片段中以单核苷酸重复居多，占总微卫星位点数的40.96%；二核苷酸重复占37.68%；三核苷酸重复占15.22%；四核苷酸重复占1.84%；五核苷酸重复占2.46%；六核苷酸占1.84%(表2)。

在单核苷酸重复类型中A/T重复出现的次数最多，为单核苷酸中的优势重复单元，共有550个(占91.67%)，占有绝对的优势；二核苷酸中AG/CT共有412个，为二核苷酸重复的优势重复单元(占74.64%)。在三核甘酸中AAT/ATT共有75个，含量最多(33.63%)，AAG/CTT共有38个(占17.04%)，其余类型较少；在四核苷酸，五核苷酸，六核苷酸中优势单元分别为AAAT/ATTT(占70.37%)，AAAAG/CTTTT(占52.78%)，AAAAAG/CTTTTT(占40.74%)。总体而言，开口箭的微卫星位点主要以A/T为主，体现了一定的碱基偏好性(表3)。

2.2 不同重复单元微卫星序列长度分布以及变异

开口箭的微卫星序列长度范围较为广泛，为10～120 bp。其中六核苷酸重复单元长度变化范围最大(24～120 bp)，其余重复类型的长度变化范围为单核苷酸重复10～85 bp，三核苷酸重复12～78 bp，四核苷酸重复12～56 bp，五核苷酸重复20～35 bp，六核苷酸重复24～84 bp。所有重复单元中，所占比例最高为AG/CT(32.49%)，且A/T为出现频率最高的碱基对。

对开口箭不同重复单元的微卫星长度变异情况进行分析，二核苷酸的长度变异程度最高，总共有27种不同的长度变化，而五核苷酸与六核苷酸重复的长度变异程度较低，分别为4种与5种(图1)。在各个重复类型中，重复的长度与微卫星的丰度呈负相关。

表2 不同重复基元类型的SSR在开口箭基因组中的出现频率

表3 不同重复基元类型SSR数量以及长度比例

2.3 开口箭基因组SSR引物设计与筛选

本研究为52个开口箭微卫星位点设计了引物对，对24个个体进行PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果表明，有21条引物未扩增出明显条带，其余31对引物在目标区域扩增出明显条带，其中有14对引物扩增出的条带稳定且有多态性(图2)。利用Powermarker 软件统计了14个位点的多态性信息(表4)，共检测出42个等位基因，平均每个位点的复等位基因数(Na)为3.0，期望杂合度(He)平均为0.339 7，观测杂合度(HO)平均为0.455 3，多态性信息含量(PIC)范围为0.336 9～0.785 6，平均为0.546 3。

2.4 引物通用性检测

从上述14引物中又筛选得到13对条带最为清晰的开口箭微卫星引物，使用这些引物对采集的6个开口箭的近缘种(长柱开口箭、弯蕊开口箭、剑叶开口箭、筒花开口箭、吉祥草和万年青)样本进行扩增，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增结果进行检测，表5结果表明，开口箭的13对引物在同属的4个近缘种中的通用性明显好于万年青和吉祥草。在长柱开口箭种群中，13对引物均能检测出等位基因，引物通用率为100%。在弯蕊、剑叶、筒花开口箭种群中有12对引物可以检测出等位基因，引物通用率为92.3%。在吉祥草和万年青种群中有9对引物可以检测出等位基因，引物通用率为69.2%。部分引物检测结果见图3。

饼图每一扇区对应不同长度的微卫星，括号内表示微卫星的重复次数。若对应长度微卫星频率=0.01，则一起合并在黑色扇区内图1 开口箭基因组序列中含不同长度重复单元的微卫星长度变异情况Microsatellites in different lengths are demonstrated in separate slices, Parentheses indicate the number of microsatellite repeats. If the corresponding percentage =0.01(white slices), slices were combined for percentages(black slices)Fig.1 Length diversification of the microsatellites in genome sequences of T. chinensis

M. PUC-18 DNA marker; 1～24.开口箭种群的24个个体图2 引物KKJSSRP10对开口箭种群的扩增产物电泳效果图M. PUC-18 DNA marker; 1-24. 24 samples from Tupistra chinensis populationsFig.2 The PCR amplification pattern of T. chinensis populations generated with primer KKJSSRP10

M. PUC-18 DNA marker; 1～27.开口箭近缘种的27个个体图3 KKJSSRP10引物扩增的开口箭近缘种DNA片段M. PUC-18 DNA marker; 1-27. 27 samples from T. chinensis relative populationsFig.3 The PCR amplification pattern of T. chinensis relative populations

表5 开口箭SSR引物的通用性检测

引物Primer检测出的等位基因No. of alleles detected长柱开口箭T. grandistigma(n =5)弯蕊开口箭T. wattii(n =5)剑叶开口箭T. ensifolia(n =4)筒花开口箭T. delavayi(n =3)吉祥草Reineckia carnea(n =5)万年青R. japonica(n =5)KKJSSRP 07111111KKJSSRP 10121111KKJSSRP 121-11-1KKJSSRP 13211111KKJSSRP 141111--KKJSSRP 15121111KKJSSRP 16112111KKJSSRP 1711111-KKJSSRP 18111211KKJSSRP 22121111KKJSSRP 2611-1--KKJSSRP 27111--1KKJSSRP 2811111-

3 讨 论

本研究从开口箭的23 362条基因组序列中共筛选出微卫星位点1 465个，含有微卫星的片段占总序列数的5.20%，较茯苓(4.57%)、短丝木樨(4.64%)等植物[6～7]微卫星含量丰富，但与天麻(8.16%)、油棕(22.6%)等植物[8～9]相比微卫星含量较低。经统计，开口箭从单核苷酸重复至六核苷酸重复单元均有分布，其中单核苷酸重复单元所占比重较大(占总数的40.96%)，其次为二核苷酸重复(37.68%)。研究表明，重复次数较低的重复单元大量存在表明该物种具有较高的进化水平[10]，而开口箭的微卫星位点以单核苷酸与二核苷酸重复为主，可见该物种起源较晚且进化水平较高。

分析开口箭各个类型的微卫星组成发现，A/T为主要重复碱基，在一定程度上表明了开口箭碱基的偏好性。碱基的偏好性实质上反映的是密码子的使用情况，不同的密码子导致氨基酸种类的不同，从而使不同植物有着不同的生理功能[11]，例如小麦等植物以C/G为主要重复类型[12]，而拟兰芥中则以A/T为主要重复类型[13]。

微卫星位点长度的多态性是影响SSR多态性的重要指标，而导致微卫星长度变异的原因主要是由于在复制过程中DNA聚合酶的滑动及酶对被滑动链的错误修复[14]。开口箭的微卫星位点长度分布范围较为广泛，为10～120 bp，且绝大多数均为低级重复单元，多态性潜能较高。

针对开口箭的微卫星组成特征，开发并筛选出了14对开口箭SSR引物。经PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明：每个位点的复等位基因数(Na)在2～4之间，平均为3.00；多态性信息含量(PIC)0.336 9～0.785 6，平均为0.546 3。表明本研究所开发并筛选出的引物具有较高的多态性，可有效地用于后期对开口箭进行遗传学研究。

多数研究表明SSR引物在植物种属间具有较高的通用性[15]。通过对开口箭的近缘种进行通用性检测，发现筛选的13对开口箭多态引物可以在长柱开口箭种群中全部检测出等位基因，12对引物可以在弯蕊、剑叶、筒花开口箭种群种检测出等位基因，9对引物可以在吉祥草、万年青种群种检测出等位基因。引物通用率分别为100%、92.3%、69.2%，说明本研究所开发的开口箭SSR引物在其近缘种中的通用率较高，可以作为直接引物在其近缘种的相关研究中应用。

本研究通过对开口箭进行了微卫星特征分析，发现开口箭微卫星位点较为丰富，长度多态性较高。所开发的14对开口箭SSR引物可用于后期开口箭遗传学的研究与近缘种的研究之中，为开口箭的遗传多样性分析、种质资源保护提供了重要的遗传学信息。