UPF1在肺腺癌中的表达及其临床意义的研究*

孙蓓 曹璐 杨灵伊 李玲妹 刘昶煦 黄秋娟 王雅蕾 齐丽莎 曹文枫

肺癌是目前发病率最高的恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的主要原因。肺腺癌（adenocarcinoma，ADC）是原发性肺癌最常见的组织学类型。肺癌患者的5年生存率低于其他癌症患者，ADC发生的相关机制阻碍了肺癌的有效治疗［1］。获取治疗ADC的分子靶点，并进行靶向治疗是目前研究的热点。因此，研究ADC的特点及其恶化的机制具有重要意义。

无意义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含有提前终止密码子（premature translational-termi⁃nation codon，PTC）的转录产物防止有潜在毒性的截短蛋白产生［2-3］。另外，在肿瘤研究中，NMD可通过靶向突变的基因蛋白发挥监管机制［4-6］。然而，NMD在肿瘤细胞营养缺乏和内质网压力高的情况下表达下调，说明肿瘤发生过程中可能抑制了NMD的发生［4］。NMD 的发生主要由UPF1、UPF2、UPF3、Y14、SMG1、SMG5、SMG6、SMG7等多种多肽发挥作用［7-8］，而上游移码突变体1（up-frame shift mutant 1，UPF1）是NMD途径中的关键参与者［9］。并且，UPF1表达的上、下调可以决定NMD过程的激活或者抑制［8，10］。

本研究应用免疫组织化学方法测定150例ADC患者的UPF1表达情况，探讨UPF1的表达与ADC各个临床病理指标的关系，以及其表达与ADC患者整体生存期（overall survival，OS）与无病生存期（recu⁃nence-free survival，RFS）的关系，以期发现新的分子靶点，指导临床治疗。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2011年1月至12月就诊于天津医科大学肿瘤医院未接受过化疗或放疗、临床病理及随访资料完整并且均经组织病理学证实的ADC患者150例。其中男性75例，女性75例。年龄＜50岁21例，≥50岁129例。从未吸过烟的患者89例，有吸烟史61例。肿瘤直径＜3 cm 72例，≥3 cm 78例。依照第8版AJCC分期，150例ADC患者中，TNMⅠ、TNMⅡ、TNMⅢ和TNMⅣ期分别为36、50、25和29例（表1）。本研究经过天津医科大学肿瘤医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 将组织在10%中性缓冲的福尔马林中固定24 h，石蜡包埋，4 μm切片厚度，常规H&E染色。使用Olympus BX51显微镜观察。

1.2.2 免疫组织化学法（SP法） 1）载玻片预处理。2）UPF1表达检测：切片置于二甲苯60℃脱蜡2次。切片逐级乙醇脱水，PBS洗3次。抗原修复液修复后等待切片自然冷却，PBS洗3次。加一抗，阴性对照以PBS代替，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次；加生物素化二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次；加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37℃水浴箱孵育30 min。PBS冲洗3次；DAB显色，显微镜下控制显色；封片后光镜Olympus数码相机照相。阳性对照由abcam公司提供。3）结果判定在光镜下观察，细胞质内出现棕黄色颗粒的细胞为UPF1表达细胞。两位病理科医师独立对UPF1的表达进行评估。采用染色阳性细胞的染色强度和染色范围得分相乘评法，总分为0～6分。阳性细胞比例为（0%～25%）评分为0，阳性细胞比例为（26%～50%）评分为1，阳性细胞比例为（＞50%）评分为2；不显色或显色模糊者评分为0（无染色），浅黄色者评分为1（弱染色），棕黄色者评分为2（中等染色），棕褐色者评分为3（强染色）。总分＞0和≤3表示UPF1的低表达，总分≥4分为UPF1高表达，0分为UPF1阴性表达。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用χ2检验评估UPF1的表达水平与不同临床病理特征（包含年龄、原发肿瘤大小、组织学类型、TNM分期、淋巴和远处转移等）之间的相关性。采用Kaplane-Mei⁃er分析UPF1的表达与生存期之间的关系。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 150例ADC患者临床病理资料

2 结果

2.1 UPF1表达水平与ADC各临床病理参数之间的关系

免疫组织化学结果显示，UPF1在ADC组织的细胞质内表达，ADC组织中细胞质内出现棕黄色颗粒的细胞为UPF1表达细胞。如表2所示，150例ADC样本中，85例（56.9%）UPF1表达阴性或弱阳性，65例（43.1%）UPF1表达阳性。UPF1表达量与患者性别、年龄、是否吸烟或肿物大小无显著相关性，与组织学类型（P＜0.001）、TNM分期（P=0.014）、淋巴结转移（P=0.016）和远处转移（P=0.035）密切相关。另外，在微乳头为主型样本中，UPF1均为阴性或低表达所占比例为100.0%（19/19）；在实性为主型的组织中比例为69.6%（16/23），乳头状癌中为40.0%（4/10），伏壁型为51.1%（23/45），腺泡状癌为39.6%（21/53）（图1）。由此可见，在实性为主型和微乳头为主型的恶性程度较高的ADC类型中，UPF1低表达率显著高于其他组织学类型。此外，UPF1表达水平还与TNM分期有关。在45例（45/64，70.3%）晚期肿瘤（TNMⅢ和Ⅳ期）和42例（42/86，48.8%）早期肿瘤（TNMⅠ和Ⅱ期）患者中发现UPF1阴性表达或低表达。ADC出现淋巴结转移中，UPF1阴性表达或低表达占67.7%（42/62，67.7%）；ADC出现远处转移中，UPF1阴性表达或低表达共占68.0%（31/45，68.0%）。UPF1阴性表达或低表达患者的淋巴结转移率（42/62，67.7%）和远处转移率（31/45，68.0%）远高于UPF1高表达患者（20/62，32.3%）和（14/45，31.1%）。150例病例中UPF1的表达情况与EGFR和K-RAS基因突变的关系如表2所示，UPF1高表达病例有41.2%（35/85，41.2%）发生EGFR基因突变；UPF1高表达病例中有4.70%（4/85，4.70%）发生K-RAS基因突变。UPF1蛋白的高低表达情况和EGFR基因突变（P=0.201）和KRAS基因突变（P=0.650）差异无统计意义。

2.2 UPF1的表达与ADC患者的生存期的关系

采用Kaplane-Meier分析UPF1的表达与患者生存的关系。UPF1的表达水平与患者的OS呈显著相关性，UPF1不表达或低表达的ADC患者OS远低于UPF1高表达的患者，UPF1低表达会显著缩短患者的OS（图2A）。UPF1的表达水平与患者的RFS存在显著相关性，UPF1不表达或低表达的ADC患者RFS远低于UPF1高表达的患者，UPF1低表达者RFS较短（图2B）。

图1 UPF1在不同类型ADC中的表达（SP×200）

表2 150例ADC患者临床病理特征与UPF1表达水平之间的关系

表2 150例肺腺癌患者临床病理特征与UPF1表达水平之间的关系（续表2）

图2 ADCUPF1高表达组和低表达组患者生存的比较

2.3 单因素及多因素分析

选取TNM分期、淋巴结转移、远处转移、UPF1表达和病理类型对150例ADC患者OS进行单因素和多因素分析发现。单因素分析中，TNM分期（P=0.029）、UPF1表达情况（P=0.009）以及伏壁型与微乳头型病理类型（P=0.021）差异具有统计学意义。选取以上进行多因素分析发现，UPF1表达情况（P=0.007）对患者生存有统计学意义（表3）。

表3 150例ADC患者OS单因素与多因素分析

3 讨论

ADC发病率近年来迅速上升，癌细胞转移是ADC治疗失败的主要原因。研究ADC发生和发展的分子机制是近年来ADC的研究热点［11-13］。NMD途径作为一种有效的mRNA降解机制，其核心分子UPF1表达的高低可以直接促进或抑制NMD的发生［4］。有报道称，UPF1在其他肿瘤中作为抑癌基因，其表达水平与肿瘤的发生、发展存在密切的相关性［14-15］。UPF1在肝细胞肿瘤和结直肠肿瘤中的研究较多，但在ADC中鲜见报道。

在本研究中，首先使用免疫组织化学分析了150例患者ADC组织样品，发现UPF1在ADC组织中的表达低于正常肺组织。此外，UPF1的表达与ADC的组织学类型（P＜0.001）、TNM分期（P=0.014）、淋巴结转移（P=0.016）以及远处转移（P=0.035）有显著相关性，而与年龄、性别、是否吸烟及肿物大小无相关性。这些研究结果表明UPF1可能是一种潜在的肿瘤抑制基因，其在ADC进展过程中发挥重要作用。另外，本研究显示，UPF1低表达的ADC患者OS较其他患者更短，术后复发率更高，且其表达情况与ADC的病理类型、TNM分期、淋巴结转移及远处转移呈显著相关性。以上研究结果表明，UPF1可以作为ADC治疗及预后评估的参考指标，并且UPF1有可能成为新的ADC药物治疗靶点。

有研究发现，通过建立模拟肿瘤生存微环境如缺氧、营养缺乏、活性氧增加等，肿瘤细胞的UPF1表达被明显下调，NMD过程被抑制［13-15］。一些mRNA的表达上调，许多利于细胞适应这种恶劣环境的生物分子量增加［16］。反过来说，UPF1表达下调抑制NMD的过程，可能促进了肿瘤细胞对恶劣环境的适应能力。肿瘤生长过程中，瘤组织紊乱的供血系统会导致严重的缺氧，营养缺乏，另外肿瘤细胞的代谢会有活性氧的产生［17-18］。肿瘤细胞的生长经常处于低氧、营养缺乏的状态，猜测肿瘤细胞中的NMD过程可能经常处于被抑制状态。传统的ADC的治疗方法主要以手术及术后辅助治疗为主。随着对ADC发生、发展机理认识的不断加深，越来越多的研究集中于新的抑瘤靶点的发现及分子靶向药物的开发。

近年来，通过对EGFR等相关信号通路的研究及对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）疗效及安全性的探索，证实了EGFR-TKIs在EGFR突变的肺癌患者中取得的确切疗效。K-RAS基因定位于人类染色体12p12.1，编码一种具有GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，定位于细胞膜内侧，是EGFR功能信号的下游分子，在膜受体到腺苷环化酶信号传导中起重要作用，相关研究证实，K-RAS基因状态与EGFR-TKIs和抗EGFR单抗治疗ADC的疗效密切相关［16-18］。本研究分析了UPF1的表达和EGFR基因突变以及K-RAS基因突变的关系，发现UPF1的表达和EGFR基因突变两者之间差异无统计意义。关于EG⁃FR突变和K-RAS基因突变与临床病理参数及预后的关系的报道不一，这可能由检测方法不同、样本量大小不同等原因造成。EGFR突变以及K-RAS基因突变与患者UPF1表达的关系以及与患者预后的关系如何，仍需进一步的多中心临床随访研究。

作为NMD的关键调节因子，UPF1低表达可能使NMD在ADC组织中被抑制。这引起了临床对NMD如何在肿瘤组织中受到抑制从而使肿瘤恶化、进展的质疑，关于其中的机制还需要进一步研究。