带皮发酵橘子酒工艺研究

蒋燕明，彭 欢，唐 赟，陈清婵

(荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000)

柑橘是我国水果产量第二的水果种类[1]，由于柑橘皮占果实重量的25%[2]，所以我国的柑橘经食用和加工后会产生大量的柑橘皮。这些柑橘皮除了一小部分被晒干制成中药陈皮或陈皮蜜饯等产品外,绝大部分都成为生产废料或生活垃圾而被丢弃,不仅会因霉烂变质而污染环境,而且也是一种资源的极大浪费[3]。实际上，橘皮营养丰富，富含类胡萝卜素，黄酮类化合物，Vc、VE，糖类和K、Mg、Ca、P等多种微量元素[4]，具有开胃通气、化痰镇咳、止吐解酒等作用，实属一种廉价的营养保健食品。橘皮酱油[5]、橘皮果醋[6-7]、橘皮果酱[8]等产品的研究已有报道，但带橘皮发酵果酒的报道还鲜有报道。橘子酒的酿造普遍是以果肉榨汁为原料，橘皮直接丢弃而其中的营养价值没有得到利用。为此，本实验将橘皮进行处理，与果肉一同打浆，通过发酵将果皮及果实中的各种营养成分、香气和色泽都融入到酒液中，从而使橘子酒香味浓郁、颜色美观，又有丰富的营养价值，同时为橘皮的深度开发利用提供了一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

橘子，湖北荆门漳河产；白砂糖，食用，市售；菌种，从橘皮中筛选的酵母菌；亚硫酸，天津市福晨化学试剂厂（分析纯）；硝酸铝，天津市福晨化学试剂厂（分析纯)；亚硝酸钠，天津市福晨化学试剂厂（分析纯)；邻苯二甲酸氢钾，天津市化学试剂一厂（分析纯)；氢氧化钠，武汉市洪山中南化工试剂有限公司（分析纯)；95%vol乙醇，武汉市洪山中南化工试剂有限公司；芦丁，北京索莱宝科技有限公司（纯度95%)；马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基），青岛高科因海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，蓟州净化；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；101-1型电热恒温干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；YXQ-LS-100S11立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程（见图1）

1.3.2 菌种的分离、纯化及筛选

（1）酵母的分离、纯化

选取1个新鲜无病虫害的橘子，在自然环境（室内）放置14 d，从其表面挑取橘皮，制得菌悬液，在PDA培养基上，30℃下平板培养3 d。观察菌落情况，然后对菌体进行镜检，分离出单个菌落，逐步进行分离、纯化[9]。取合适的菌体反复进行平板培养、分离、观察、镜检，将适宜菌株转移至试管斜面PDA培养基，以30℃进行增殖培养，3 d时转移到4℃冰箱中保藏备用[10]。

图1 橘子酒发酵流程图

表1 酒液评分标准[13]

（2）菌落形态学鉴定

参照《真菌鉴定手册》[11]和《酵母菌的特征与鉴定手册》[12]，对酵母进行形态学鉴定。

（3）菌种液制备

从斜面培养基上取1环活化菌种接入50 mL马铃薯葡萄糖液体培养基（马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1000 mL，121℃下灭菌15 min）30℃培养3 d。菌种液酵母菌浓度达到3.3×107cfu/mL。

（4）菌种的筛选

将菌种分别加入带皮橘汁中，在30℃下发酵5 d。将发酵好的橘子酒给6位师生进行感官评定，感官评分标准见表1，满分100分。取6位成员评分的平均值为最终得分，通过最终得分筛选菌种。

1.3.3 发酵工艺单因素实验

(1)带皮橘汁的制备

选择成熟无病虫害的新鲜橘子，剥下橘皮清洗，并将橘皮于95℃以上水中烫2～3 min[6]。橘子分瓣，橘皮和橘子汁一起打浆，皮和果肉比例约为1∶5。向橘子果浆中加入水，比例为水∶汁=1∶3，得到待发酵橘子液。

(2)糖度对发酵的影响

调整混合汁的糖度以提升酒精度，使糖度(°Bx)分别为12、14、16、18、20。发酵条件为SO2添加量为60 mg/L，酵母添加量为0.3%，发酵时间为5 d，温度为30℃。发酵结束后，测定糖度、酒精度、黄酮含量。

(3)SO2添加量对发酵的影响

向混合橘子汁中添加亚硫酸，使SO2添加量分别为20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L。发酵条件为糖度16°Bx，酵母添加量为0.3%，发酵时间为5 d，温度为30℃。发酵结束后测定糖度、酒精度、黄酮含量。

(4)酵母接种量对发酵的影响

向混合橘子汁中添加选育的酵母菌，添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。发酵条件为发酵条件为糖度16°Bx，SO2添加量为60 mg/L，发酵时间为5 d，温度为30℃。发酵结束后测定糖度、酒精度、黄酮含量。

(5)发酵温度对发酵的影响

发酵温度（℃）设为18、22、26、30、34。发酵条件为糖度16 °Bx，SO2添加量为60 mg/L，酵母添加量为0.3%，发酵时间为5 d。发酵结束后测定糖度、酒精度、黄酮含量。

1.3.4 发酵工艺正交试验设计

选取糖度、SO2添加量、酵母添加量、发酵温度4个因素及其3个水平进行4因素3水平正交试验，以最终的酒精度，感官评分为评价指标，对实验结果进行方差分析，得到最优的发酵工艺条件。感官评分标准见表1，正交试验因素与水平见表2。

表2 正交试验因素与水平

1.3.5 测试指标与方法

糖度：手持糖度计法。

酒精度：蒸馏法。用容量瓶取100 mL酒样于500 mL蒸馏瓶中，用50 mL水洗容量瓶后并入蒸馏瓶中，收集馏出液100 mL，冷却后用酒精计测量并按20℃条件下的值校正。

黄酮含量：铝盐分光光度法。标准曲线见图2。

图2 黄酮含量标准曲线

1.3.6 数据处理

所有试验指标测定3次，取平均值；试验数据用Excel软件处理。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种分离、纯化及筛选结果

反复进行多次分离、纯化，得到了符合酵母特征的初筛酵母菌2株，分别命名为JP-1、JP-2。2株菌株在PDA培养基上30℃培养3 d后，观察其菌落形态，酵母的菌落及个体形态结果，分别用JP-1、JP-2发酵的带皮橘子酒的感官评定结果见表3。

表3 酵母的菌落及个体形态

由感官评定结果选择菌株JP-1作为发酵菌株。

2.2 发酵工艺单因素实验结果

2.2.1 糖度对发酵的影响（图3、图4）

由图3、图4可知，酒精度随着原液中初始糖度的增加而升高，在糖度为20°Bx时，达到最大，为8.3%vol，因其可转化成酒精的糖增多了。随着初始糖度的增加，残糖含量也有所增加，原液初始糖度为20°Bx时，达到最大，为6.9°Bx。黄酮含量也随着初始糖度的增加而增加，最大为0.215 mg/mL。这是可能是由于酒精浓度的增加，溶解在酒液中的黄酮含量也随之增加[14]。

图3 初始糖度对酒液中糖度和酒精度的影响

图4 初始糖度对黄酮含量的影响

2.2.2 SO2添加量对发酵的影响（图5、图6）

图5 SO2添加量对糖度和酒精度的影响

图6 SO2添加量对黄酮含量的影响

由图5、图6可知，随着SO2添加量的增加，酒精度先增大后减小，酒精度在SO2添加量为80 mg/L时，达到最大值，为6.3%vol。这是由于SO2添加量的增大，抑制了杂菌的生长[15]，为酵母菌的繁殖创造了有利条件，从而使酒精度升高，同时SO2添加量过量时，也会抑制酵母菌的生长，所以酒精度又下降。黄酮含量与酒精浓度相关，在80 mg/L时达到了最大值，为0.320 mg/mL。

2.2.3 酵母接种量对发酵的影响（图7、图8）

图7 酵母添加量对糖度和酒精度的影响

图8 酵母添加量对黄酮含量的影响

由图7、图8可知，酵母接种量是影响乙醇发酵的重要因素之一，在不同的接种量条件下，酵母利用各种发酵性物质转化为酒精的量是不同的[16]。随着酵母添加量的增加，酒精度先升后降，在酵母添加量为0.3%时，达到最大，为8.3%vol。这是由于酵母添加量增大，其繁殖能力增强，产酒精量多，而酵母量过大时，繁殖竞争力增大，代谢产物过多反而抑制了其生长发酵。酒液中的糖度依然与酒精度呈负相关。黄酮含量随着酵母添加量的增加先升高后降低，在酵母添加量为0.3%时，达到最大为0.292 mg/mL。一方面是因为酒精体积分数的增加酒液中溶解的黄酮含量增加，另一方面是由于溶液中的酵母增加，其代谢产生的丙酮酸、乙醛等与黄酮产生一些大分子衍生物，致使黄酮含量下降。

2.3.4 发酵温度对发酵的影响（图9、图10）

图9 发酵温度对糖度和酒精度的影响

图10 发酵温度对黄酮含量的影响

由图9、图10可知，发酵温度对发酵结果的影响较大，发酵温度为18℃时酒精度最低，为2.7%vol，在30℃时达到最高为7.7%vol。这是因为在18℃时的酵母菌繁殖能力弱，产酒精能力低，在30℃时所用酵母菌适合生长繁殖，产酒精能力强。糖度与酒精度呈负相关。黄酮含量与酒精浓度呈正相关，在30℃时达最大值0.308 mg/mL。

2.3 发酵工艺的正交试验结果

2.3.1 正交试验方案及结果

为确定最佳发酵条件，在单因素的基础上，以糖度、SO2添加量、接种量、发酵温度为因素设计L9（34）正交试验，以酒精度和感官综合评分为评价标准，正交试验结果见表4、表5。

表4 发酵工艺因素正交试验结果

表5 发酵工艺因素正交试验指标分析

由表5可知，以酒精度为指标的分析中，极差RA＞RC＞RB＞RD，所以因素主次为A＞C＞B＞D，即初始糖度＞接种量＞SO2添加量。发酵温度又因为酒精度越大越好，取各因素最大K值所对应的水平，即为 A3B3C2D2，即糖度 20 °Bx，SO2添加量为100 mg/mL，酵母添加量为0.3%，发酵温度为30℃。

以感官评分为指标的分析中，极差RD＞RC＞RA＞RB，所以因素主次为D＞C＞A＞B，即发酵温度＞接种量＞初始糖度＞SO2添加量。综合感官评分结果，取各因素最大K值所对应的水平，即为A3B3C3D2，即糖度20 °Bx，SO2添加量为100 mg/mL，酵母添加量为0.4%，发酵温度为30℃。

在以上指标分析结果中，除了酵母添加量的水平取值不同，其他因素水平选取相同。而酵母添加量在两个指标分析中所占主次地位相同，所以需要进行验证实验。

2.3.2 正交试验优化结果验证（表6）

表6 验证试验结果

由表6可知，A3B3C2D2和A3B3C3D2方案所得的果酒的品质都较好,酒精度含量高,感官评价良好,且分数相差不大。因此,考虑经济因素,选择A3B3C2D2为带皮橘子酒发酵最优方案，即加水比例为1∶3，糖度20 °Bx，SO2添加量为100 mg/mL，酵母添加量为0.3%，发酵时间为6 d，发酵温度为30℃。测得其黄酮含量为0.330 mg/mL。

3 结论

经单因素和正交试验得出，带皮橘子酒发酵最佳工艺为：糖度为20 °Bx，SO2添加量为100 mg/L，酵母添加量为0.3%，发酵时间为5 d，发酵温度为30℃。酒精度达到9.4%vol，黄酮含量为0.330 mg/mL。本工艺方案酿造的柑橘果酒保留了橘子的风味和营养价值，同时添加了橘皮中特有的风味和营养物质，使成品清香怡人，具有良好的营养保健价值。