层层自组装复合电极用于检测牛奶中三聚氰胺

李萌萌， 李冬迪， 罗仙科， 郭 卓

(沈阳化工大学 材料科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

三聚氰胺(Melamine,C3H6N6)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，作为一种化工原料常被添加到塑料、纤维和胶水中以提高产品性能.由于三聚氰胺中氮的含量约占66 %(质量分数)[1]，比蛋白质还高，并且价格低廉[2]，所以，一些不法商贩为了个人利益将其加到乳制品或食品中，造成高蛋白的假象.长期摄入三聚氰胺不仅会导致生殖、泌尿系统的损害、衰竭[3]，甚至还会造成死亡.因此，准确快速地检测出牛奶中的三聚氰胺对于保证食品安全具有非常重要的意义.

目前，检测三聚氰胺的方法有很多，比如：高效液相色谱法(HPLC)[4],气相/液相色谱-质谱分析法(GC/LC-MS)[5-6]，联酶免疫吸附测定法(ELISAS)[7]及毛细管电脉质谱分析法(CE-MS)[8]等.这些方法的弊端在于需要贵重的检验设备和复杂的预处理过程，不适用于常规的检测.而电化学检测方法是一种操作简单、灵敏度高的分析方法，它可以用于食品中三聚氰胺的检测[9].

金纳米粒子具有良好的生物相容性、良好的光学和电学特性，被广泛应用于三聚氰胺的检测.例如， Su 等[10]制备金纳米粒子，用3-巯基丙磺酸盐修饰后加入预处理过的含有三聚氰胺的婴儿奶粉溶液中，与奶粉中三聚氰胺结合后，溶液由红色变成了蓝色，可以对三聚氰胺进行检测；Ai等[11]采用MTT(1-(2-巯基乙基)-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮)修饰的金纳米探针测定三聚氰胺，具有较高灵敏度；Liang等[12]采用巯基乙胺修饰金纳米探针，实现了奶粉中三聚氰胺的检测.

氧化石墨烯(GO)是由碳原子构成二维片状结构，其表面含有很多的含氧官能团，在水中易分散，比表面积大，具有很好的导电性能，在生物检测和电容器方面具有广泛的应用.本实验采用的是电化学方法.首先，将氧化石墨烯涂到电极上，制备GO/GCE修饰电极；然后，利用层层自组装方法，把1，4-二硫苏糖醇(DTT)、金纳米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)组装到GO/GCE修饰电极表面，制备了GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE复合电极；此复合电极与三聚氰胺之间产生氢键作用，可以对牛奶中痕量的三聚氰胺产生响应.同时，该方法简单方便，成本低，易于推广，可以实现对三聚氰胺的高选择、高灵敏的检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯金酸(HAuCl4)、L-半胱氨酸(L-Cys)、柠檬酸钠、纳米石墨粉均购于上海阿拉丁试剂有限公司；1,4-二硫代苏糖醇(DTT)、铁氰化钾均购于国药集团化学试剂有限公司(上海)；三聚氰胺、浓硫酸、双氧水、盐酸、高锰酸钾、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇、丙酮和氯化钾试剂均购于天津化学试剂公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)按标准配制成不同 pH 溶液.所有试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水.玻碳电极的处理：将电极在麂皮上用氧化铝粉抛光，依次用丙酮、乙醇、蒸馏水各超声10 min，烘干，备用.

Autolab-PGSTAT302N 电化学工作站购于瑞士万通中国有限公司.三电极系统：工作电极为修饰的玻碳电极，辅助电极为铂丝，参比电极为饱和甘汞电极.检测方法有循环伏安法(CV)、微分脉冲伏安法(DPV)和电化学阻抗(EIS).NICOLET-560 型红外光谱仪购于美国 Nicilet 公司，光谱区域 400～4 000 cm-1.透射电子显微镜(H-600)，日本株式会社日立制作所.

1.2 实验过程

1.2.1 氧化石墨烯(GO)的制备

采用传统Hummers[13]法来制备GO.GO的制备：在冰水浴条件下，往三口瓶中加入0.6 g纳米石墨(40 nm)和1.0 g NaNO3，再倒入35 mL冷藏的浓H2SO4，搅拌40 min；再称取3 g KMnO4，缓慢加入三口烧瓶中，继续搅拌2 h；撤掉冰浴并将反应体系温度升至35 ℃，在此温度下继续搅拌30 min；接着将150 mL去离子水缓慢加入体系中，将反应体系升温至98 ℃，继续搅拌15 min；最后，将反应完的溶液缓慢倒入提前预热的200 mL去离子水中搅拌，随后向溶液中滴加双氧水至没有气泡产生，静置分层将上层清液倒出，下层溶液用蒸馏水洗至中性，离心分离，得到GO分散液.

1.2.2 纳米金的制备

纳米金溶液的制备[14]：取1 mL摩尔分数为0.01 %的氯金酸(HAuCl4)溶液加入到100 mL去离子水中，然后向其中迅速加入1 mL摩尔分数为1 %的柠檬酸钠水溶液，在100 ℃的条件下加热搅拌30 min；溶液会从浅蓝色变成紫红色，最后形成酒红色金纳米粒子(AuNPs)溶液.

1.2.3 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE纳米修饰电极的制备

将上述制备好的氧化石墨烯配成1 g/L溶液，涂在已处理好的玻碳电极上，真空干燥；然后采用自组装的方法，将氧化石墨烯修饰的玻碳电极浸泡在浓度为50 mmol/L DTT 的乙醇溶液中12 h，然后用蒸馏水冲洗；再将电极浸入到制备好的金纳米粒子溶液中，让电极在4 ℃冰箱内组装24 h，蒸馏水清洗；再浸泡在浓度为20 mmol/L的L-Cys溶液中12 h，取出电极后用超纯水冲洗干净后待用.

1.2.4 奶粉样品的处理

精密称取牛奶样品，加入乙腈，充分振荡，然后添加一定量三聚氰胺标液，用pH=7.0的PBS缓冲溶液稀释至100 mL，在10 000 r/min速度下离心10 min，取上清液作为提取液.取提取液1 mL，用5 mmol/L K3[Fe(CN)6](pH=6.80)溶液稀释到10 mL，采用DPV法进行检测，并计算标准样品的回收率.

2 结果与讨论

2.1 氧化石墨烯和Au纳米粒子的表征

图1 为氧化石墨烯和金粒子的透射电子显微镜图.从图1可以看出：氧化石墨烯成片层结构，有很多小褶皱，具有大的比表面积；金纳米粒子的粒径大约是50 nm.

图1 氧化石墨烯和金纳米粒子的TEM

2.2 电极的层层自组装

由图2(a)可知：石墨粉被氧化后表面包含了很多的含氧官能团，在3 400 cm-1处出现了一个较宽、较强的吸收峰，这是—OH 的伸缩振动峰；在 1 723 cm-1、1 386 cm-1和1 050 cm-1出现的吸收峰分别为C==O伸缩振动、—OH 的变形振动以及C—O的伸缩振动[15].当将GO/GCE电极浸泡在DTT中时，如图2(b)，—OH的吸收峰变强，并且在2 556 cm-1和600 cm-1出现了新的吸收峰，分别为—SH和—C—S—的振动峰，说明DTT组装在GO上[16].在GO/GCE电极浸入金纳米溶胶后[图2(c)],—SH从2 556 cm-1移动到2 543 cm-1，说明Au纳米粒子与—SH发生了配位.电极浸泡在L-Cys溶液中，如图2(d)所示，新出现的吸收峰为1 651 cm-1和1 400 cm-1，分别是—N—H的弯曲振动及—C—N—的伸缩振动[17]，说明各物质层层自组装在玻碳电极上.当电极与Melamine发生氢键作用时[图2(e)]，在3 469 cm-1、3 421 cm-1、3 135 cm-1处出现了N—H的伸缩振动峰[18]，1 554 cm-1是C==N的伸缩振动峰[19],同时，1 723 cm-1处C==O的峰变弱，说明三聚氰胺与L-Cys形成了氢键.

(a) GO (b) GO-DTT (c) GO-DTT-AuNPs(d) GO-DTT-AuNPs-L-Cys (e) GO-DTT-AuNPs-L-Cys-Melamine

2.3 修饰电极的电化学性能

如图3所示，在1.0 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(包含0.5 mol/L KCl)的混合溶液中，在-0.2～0.6 V 的电压范围，以100 mV/s的扫描速率内对不同的修饰电极进行CV扫描，并将各CV曲线进行对比.图中裸电极(曲线a)有一对清晰的氧化还原峰，ΔEp为0.13 V.当修饰氧化石墨烯后(曲线b)，氧化还原峰明显变弱.这是因为氧化石墨烯表面有很多含氧基团，阻碍了电子转移.对于电极GO/DTT/GCE(曲线c)，当加入DTT以后，氧化还原峰继续变小，ΔEp增大.这是因为DTT是惰性传质层[20]，阻碍了电子传递到玻碳电极表面上[21].当组装Au胶体后(曲线d)，由于Au具有非常好的导电能力，氧化还原峰电流增大，促进了[Fe(CN)6]3-/4-电子之间的转移.当组装L-Cys后(曲线e)，L-Cys电子传递能力较差，曲线的氧化还原峰电流值降低.此结果说明各组分很好地组装在一起，相互作用，形成了很好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极.

图4为不同电极的EIS图，阻抗的检测频率范围在0.1～105Hz.根据Nyquist(EIS)图在高频处半圆的直径和等效电路图，可以大约计算出电子转移电阻[9].曲线a为空白电极，它的电子转移电阻为194 Ω；电极修饰GO后(曲线b)，其半圆直径变大，导电的速率降低，电阻为343 Ω；与GO/GCE相比，电极GO/DTT/GCE阻抗增大(曲线c)，这是因为DTT阻碍了电子的转移，降低了其电导率.组装金胶体后(曲线d)，半圆的直径明显变小，其电阻降低至129 Ω；曲线e为GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE复合电极的阻抗，导电性能比GO/DTT/AuNPs低，电子转移的阻抗值为241 Ω.说明了此电化学传感器的电极通过层层组装，很好地结合在一起，并且形成了良好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极，与CV检测的结果一致.

(a) bare/GCE (b) GO/GCE (c) GO/DTT/GCE(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e) GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

(a) bare/GCE、(b) GO/GCE、c.GO/DTT/GCE、(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e)GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

2.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极对三聚氰胺的检测原理

层层自组装(LBL) 以正负电荷间的静电作用为驱动力，通过带相反电荷的单元交替沉积构筑逐层组装多层膜.当用组装好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修饰电极来检测三聚氰胺溶液时，工作原理如图5所示.

图5 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极对三聚氰胺的检测原理

三聚氰胺没有电化学活性，但能与L-Cys上的羧基发生氢键作用，生成的物质具有电化学响应；并且随着三聚氰胺浓度的增加，产生的电化学响应增大，因此，可用于三聚氰胺检测.

2.5 反应条件的优化

2.5.1 pH对峰电流的影响

图6是5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺在不同pH(5.8～8.0)的磷酸盐缓冲溶液中的DPV响应.pH在5.8～7.0范围内，在pH达到7.0时，峰电流达到最大值；pH继续增大，峰电流逐渐变小.所以，当pH=7.0时检测三聚氰胺的结果最佳.

图6 不同pH对峰电流的影响

2.5.2 DDT浓度对峰电流的影响

从图7中可以看出：在DTT浓度比较低时，电流随着DTT浓度的增加而增大，在DTT浓度为50 mmol/L时电流达到最大；随后，随着DTT浓度的增加而电流逐渐降低.这是因为，随着DTT浓度的增加，有更多的DTT分子与氧化石墨烯自组装到一起，有更多的巯基与Au配位，进而与更多的三聚氰胺分子产生响应；但是，随着DTT浓度的进一步增大，电极传输电子的能力降低，从而电流逐渐减小.所以，在后面的实验中选用DTT的浓度为50 mmol/L.

图7 DDT浓度对峰电流的影响

2.5.3 L-Cys浓度对峰电流的影响

从图8中可以看出：电流随着L-Cys浓度的增加而增大，在L-Cys浓度为20 mmol/L时达到最大，随后随着L-Cys浓度的增加电流逐渐降低.这是因为，三聚氰胺与L-Cys上的羧基发生氢键作用，生成的物质具有电化学响应，随着L-Cys浓度的增加，更多的L-Cys分子与三聚氰胺发生反应，产生的电化学响应增大；但是随着L-Cys浓度的继续增大，反应生成的物质使电极厚度增加，阻碍了电子的传输，使电流下降；在L-Cys的浓度是20 mmol/L时达到最大值.在后面的实验中选用L-Cys的浓度为20 mmol/L.

图8 L-Cys浓度对峰电流的影响

2.5.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极与三聚氰胺作用时间对峰电流的影响

复合电极与三聚氰胺作用时间对峰电流的影响如图9所示.

图9 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极与三聚氰胺作用时间对峰电流的影响

从图9中可以看出：GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极与三聚氰胺作用时间达到12 h时，产生的电流响应最大.这是因为，随着电极与三聚氰胺作用时间的增加，更多的三聚氰胺分子配位到电极表面，使电流增加；但是，随着作用时间继续增加，三聚氰胺在电极表面饱和，继续增加作用时间，电流反而减小.所以，在后面的实验中选用作用时间为12 h.

2.6 三聚氰胺的检测

在0.1 mol/L pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修饰电极对1.0×10-7～1.0×10-3mol/L的三聚氰胺溶液进行DPV检测，结果如图10所示.

a 1.0×10-7 mol/L b 8.0×10-7 mol/Lc 3.0×10-6 mol/L d 5.0×10-6 mol/Le 1.0×10-5 mol/L f 2.0×10-4 mol/Lg 6.0×10-4 mol/L h 1.0×10-3 mol/L

从图10曲线a～h可以看出：随着三聚氰胺浓度的不断增大，氧化峰的电流也在逐渐增大.三聚氰胺浓度与峰电流值在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L和1.0×10-5～1.0×10-3mol/L范围内分别成线性关系，其线性方程为：

Ipa=11.17+0.85c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-7～1.0×10-5mol/L，R=0.995)

(S/N=3)

Ipa=13.48+0.02c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-5～1.0×10-3mol/L，R=0.992)

(S/N=3)

其最低检测限为1.0×10-8mol/L.

2.7 电极的重复性和稳定性

为了检测GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极的重复性，对pH=7.0， 5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺溶液检测8次.8次检测的峰电流相对标准偏差为2.42 %，说明该电极具有良好的重现性.再将制备好的电极在空气中放置21 d，然后进行检测.检测结果比初始结果下降了2.8 %，表明该修饰电极的稳定性良好，使用寿命长，可以广泛地应用.

2.8 实际样品的检测

考察GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE电极对牛奶中三聚氰胺的检测.采用标准加入法，在牛奶样品中加入不同浓度的三聚氰胺，经预处理后，用DPV法测试其浓度，计算回收率，结果见表1.

表1 修饰电极检测牛奶样品中三聚氰胺的回收率

3 结 论

首先制备了氧化石墨烯修饰电极，然后将1，4-二硫苏糖醇、金纳米粒子、L-半胱氨酸通过层层自组装方法组装在氧化石墨烯修饰电极表面上，用来检测牛奶中三聚氰胺含量.结果表明，由于修饰电极与三聚氰胺之间有氢键作用，使响应电信号增强，峰电流值变大.该电极制备经济简单，检测范围在1.0 × 10-7～1.0 ×10-3mol/L，最低检测限是1.0 × 10-8mol/L.该电极的重复性和稳定性良好，可广泛用于奶制品中三聚氰胺的检测.