生菜中蜡样芽孢杆菌污染水平风险分析

赵新，兰青阔，陈锐，刘娜，朱珠，王成，沈晓玲，王永

（天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津300381）

生菜一直以来都是我们餐桌上较为常见的鲜食蔬菜，一般不经过加热简单清洗后直接食用，多以凉拌、生吃为主，营养丰富、口感清爽。但生菜属于低矮植株，极易受到各种交叉污染的侵袭，又因其叶片层层叠生，褶皱凹凸，感染细菌后不易清洗，因此，在近几年的例行风险监测中，生菜中各种风险因子的检出水平一直高居不下，已引起相关部门的高度关注[1]。鲜切蔬菜即食性的特点使其具有较高的安全风险，据估计，美国在1998年～2008年因食用果蔬（包括新鲜蔬菜和加工蔬菜）引起的食源性疾病占到了食源性疾病总数的46%[2－3]。

蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus简称B.cereus）是一种在米制品、肉制品、海鲜、乳品、蔬菜中比较常见的产芽孢细菌，同时也是主要的食源性条件致病菌，主要为腹泻型和呕吐型两种类型[4]。食品中蜡样芽孢杆菌数量超过105CFU/mL，即可引起腹泻和呕吐，偶见引起眼疾、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病，在我国细菌性食物中毒事件中，由蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件近年来跃居前三位，因此其关注度在逐渐升高[5－6]。

为进一步了解即食生菜中蜡样芽孢杆菌的污染水平，选取市售和基地的大棚、露地和水培生菜等不同栽培模式的生菜进行蜡样芽孢杆菌污染的主动监测，获取相关数据。同时进行消费者对生菜的购买需求、食用方式、存放方式等的市场调研，搜集了一定的基础调研数据。通过@Risk 6风险评估软件[7－8]，预测消费者因食用被蜡样芽孢杆菌污染的生菜所面临的风险，同时根据评估结果提出相应管控措施，以保证消费者健康食用。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2017年6月～10月，在天津市蓟州和宝坻分别选择2个生菜生产基地作为采样点，按照无菌采样原则采集水培生菜，共60份，每份500 g～1 000 g；同时按照无菌采样原则采集基质、井水、营养液等环境样本，共30份，每份500 g/mL～1 000 g/mL。在天津市南开区、西青区、河北区和东丽区选择4个大型农贸市场作为采样点，按无菌采样原则采集大棚、露地生菜，共32份。每份样品用无菌袋封闭，独立包装，避免交叉污染，采样后置低温冷藏箱储运，6 h内运回实验室，24 h内完成检验。

1.2 培养基与仪器设备

甘露醇卵黄多黏菌素（mannitol－egg－yolk－polymyxin，MYP）琼脂基础、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、生化鉴定试剂盒等：北京陆桥技术有限责任公司。

JYD－400拍击式均质器：上海之信仪器有限公司；SQ810C全自动高压灭菌锅：日本YAMATO有限公司；DRP－9272电热恒温培养箱：上海一恒有限公司；PL602－L电子天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；S1电动移液器：Thermo有限公司；生物安全柜：ESCO公司；CJ－2F超净工作台：苏州市金燕净化设备有限公司；CX31显微镜：奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 样品检测

以无菌操作称取生菜检样25 g，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液的均质袋中，充分均质混匀，按照GB/T 4789.14－2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》检验方法进行定量检测，根据证实为蜡样芽孢杆菌阳性的菌落数，应用公式进行计算，报告每克生菜中蜡样芽孢杆菌的菌落数，最低检出限为＜10 CFU/g。同时在基地中采集与生菜生长相关的环境样本（基质、水、营养液等）按照上述方法进行蜡样芽孢杆菌定量检测，分析可能污染来源。

1.3.2 膳食调查

随机选取200人，利用统一的问卷进行膳食调查，问题包括生菜购买后储存时间、购买后存储方式、食用前清洗方式、食用方式、当天食用量占全部购买量的多少、家庭中食用生菜的人数、食用人性别、人均每餐生菜食用量、人均每星期生菜食用次数，由此了解天津市居民对生菜的消费情况。

1.3.3 污染水平分析

为便于计算，当生菜试样中蜡样芽孢杆菌浓度低于最低检出限时，则假设蜡样芽孢杆菌菌量为最低检出限的50%（5 CFU/g）；当定性结果为阳性，而定量结果为阴性时，也就是生菜试样中的样芽孢杆菌实际待菌量低于10 CFU/g时，则假设蜡样芽孢杆菌菌量为10 CFU/g。参照Combase数据库中蜡样芽孢杆菌基础预测模型，结合膳食调查结果，获得不同温度条件下蜡样芽孢杆菌的最大比生长速率。应用@Risk 6风险评估软件设置变量参数，进行生菜中蜡样芽孢杆菌定量风险评估，结合现有数据分析生菜中蜡样芽孢杆菌污染水平。

2 结果与分析

2.1 基地水培生菜中蜡样芽孢杆菌筛查结果

根据天津地区水培生菜种植情况，选取宝坻区和蓟州区2家水培生菜种植基地作为定点取样基地，根据市场销售情况每家基地选取4种～5种水培生菜品种，先后共采集样本60份，经GB/T 4789.14－2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》方法检验，蜡样芽孢杆菌均有不同程度的检出。宝坻区30份水培生菜中蜡样芽孢杆菌最低污染量为5 CFU/g，最高污染量为500 CFU/g，平均污染量为147.9 CFU/g；蓟州区30份水培生菜中蜡样芽孢杆菌最低污染量为38 CFU/g，最高污染量为2 550 CFU/g，平均污染量为691.9 CFU/g，如表1所示。

表1 基地水培生菜中蜡样芽孢杆菌筛查结果Table 1 Screening results of Bacillus cereus in the lettuce of the base

续表1 基地水培生菜中蜡样芽孢杆菌筛查结果Continue table 1 Screening results of Bacillus cereus in the lettuce of the base

2.2 基地水培生菜蜡样芽孢杆菌可能污染来源分析

宝坻区种植基地水培生菜的生长模式为基质育苗后，水培床统一供水培养，定期添加营养液，因此其环境样本主要为基质、井水和营养液；蓟州区种植基地水培生菜的生长模式为基质培养后，水培床统一供水培养，不添加营养液，因此其环境样本主要为基质和井水。先后共采集样本30份，经GB/T 4789.14－2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》方法检验，其中基质和营养液中蜡样芽孢杆菌均有不同程度的检出，井水中均未检出。宝坻区18份环境样本中蜡样芽孢杆菌最低污染量为0.5 CFU/g，最高污染量为2 400 CFU/g，平均污染量为545.3 CFU/g；蓟州区12份环境样本中蜡样芽孢杆菌最低污染量为0.5 CFU/g，最高污染量为9 350 CFU/g，平均污染量为4 558.6 CFU/g，如表2所示。

2.3 市售露地大棚生菜中蜡样芽孢杆菌筛查结果

根据露地大棚生菜在天津地区市场流通环节的销售情况，选取4家农贸市场，于6月～10月份进行蜡样芽孢杆菌风险筛查，评估总量32份，结果显示，其中13份样本蜡样芽孢杆菌有不同程度的检出，蜡样芽孢杆菌的最低污染量为5 CFU/g，最高污染量为2 200 CFU/g，平均污染量为136.3 CFU/g，具体结果见表3。

表2 环境样本中蜡样芽孢杆菌筛查结果Table 2 Screening results of Bacillus cereus in environmental samples

表3 市售露地大棚生菜样本中蜡样芽孢杆菌筛查结果Table 3 Screening results of Bacillus cereus in lettuce samples in the market

2.4 膳食调查结果

根据天津市居民食用生菜的消费习惯，针对@Risk 6软件对风险因素的分析，设置9道问题，随机调研200份问卷，居民购买生菜之后习惯12 h内食用的占13%、24 h内食用的占61%、48 h内食用的占19%、48 h以上占7%，居民购买生菜之后习惯冰箱存储的占65%、室温存储的占35%，具体汇总结果如表4。

表4 问卷调研结果汇总Table 4 Summary of questionnaire survey results

2.5 污染水平分析结果

结合生菜中蜡样芽孢杆菌的筛查结果、家庭食用生菜的膳食调研结果、蜡样芽孢杆菌食物中毒诊断标准（105CFU/g）以及蜡样芽孢杆菌预测模型参数，设置生菜中蜡样芽孢杆菌污染水平分析微生物定量风险评估（quantitative microbial risk assessmeht，QMRA）模型，模型中的参数分布均以@Risk 6软件的语法设立，具体见表5。

表5 污染水平QMRA模型Table 5 The pollution level QMRA model

经@Risk 6软件1 000次迭代模拟宝坻水培生菜食用时蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布为89.2%在 0.55 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超过中毒诊断标准5 lg（CFU/g）的概率为10.7%；蓟州水培生菜食用时蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布为87.7%在0.70 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超过中毒诊断标准5 lg（CFU/g）的概率为12.3%；宝坻水培生菜食用时蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布为92.6%在0.20 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超过中毒诊断标准5 lg（CFU/g）的概率为 7.1%，具体见图1～图3。

针对天津地区水培、露地、大棚生菜的初始污染水平筛查结果，应用@Risk 6风险评估软件，分析发现贮藏温度、贮藏时间、初始污染量、污染比例与最终污染量/概率分布的相关系数依次为 0.81、0.45、0.26、0.08，其中贮藏温度与最终污染量/概率分布相关性最大，如图4所示。若将贮藏温度严格控制在冰箱7℃保存，宝坻基地水培生菜100%的最终污染量/概率分布在2.675 lg（CFU/g）以下，蓟州基地水培生菜100%的最终污染量/概率分布在2.975 lg（CFU/g）以下，市售露地大棚生菜100%的最终污染量/概率分布在2.625 lg（CFU/g）以下，如图5～图7。因此，控制相关性最大的贮藏温度，可有效地保证宝坻基地水培生菜、蓟州基地水培生菜、市售露地大棚生菜在现有200份居民食用习惯调研数据下的食用安全性。

图1 宝坻水培生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.1 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Baodi base

图2 蓟州水培生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.2 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Jizhou base

图3 市售露地大棚生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.3 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in outdoor shed lettuce of market

图4 水培露地大棚生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布相关系数Fig.4 The final pollution/probability distribution correlation coefficient of the Bacillus cereus in the lettuce

3 结论

宝坻基地、蓟州基地、市售露地大棚92份生菜的筛查结果表明，蜡样芽孢杆菌的初始污染量均在＜10 CFU/g～103CFU/g范围内，通过查阅相关文献和网站，国内还没有蜡样芽胞杆菌的限值标准，检测还停留在风险监测阶段，参照WS/T 82－2006《蜡样芽孢杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》，中毒食品中蜡样芽孢杆菌的数量不得超过5 lg（CFU/g），水培生菜中蜡样芽孢杆菌初始污染量虽均不高于中毒诊断限量值，但经居民购买后经过不同时间和方式的存放后，最终食用时的蜡样芽孢杆菌的污染量可能存在相对风险隐患，需进一步评估分析。

图5 宝坻基地水培生菜冰箱7℃贮藏方式下蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.5 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Baodi base storaged fridge 7℃

图6 蓟州基地水培生菜冰箱7℃贮藏方式下生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.6 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Jizhou base storaged fridge 7℃

图7 市售露地大棚生菜冰箱7℃贮藏方式下生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布Fig.7 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in outdoor shed lettuce of market storaged fridge 7℃

基地水培生菜的初始污染量较市售露地大棚生菜明显偏高，这与水培生菜的水床流通式栽培模式相关，建议基地水培生菜采取有效的风险管理措施，严格控制初始污染量及基质和营养液的环境交叉污染。通过分析宝坻基地和蓟州基地的污染可能来源，发现蓟州基地的基质中蜡样芽孢杆菌的污染水平明显偏高，宝坻基地的营养液中的蜡样芽孢杆菌在污染水平存在一定风险，由此得出结论，蓟州基地中水培生菜中检出的蜡样芽孢杆菌大部分来源于基质，通过根系扩展到生菜的茎叶，宝坻基地中水培生菜中检出的蜡样芽孢杆菌大部分来源于营养液，通过根系扩展到生菜的茎叶。因此建议种植户在购买基质和营养液的时候能加大对蜡样芽孢杆菌的监控，在源头上控制蜡样芽孢杆菌的蔓延和生长。

应用@Risk 6风险评估软件，结合宝坻基地水培生菜、蓟州基地水培生菜、市售露地大棚生菜的初始污染量筛查结果，评估居民购买生菜后经不同温度和时间存放后食用时生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量超过中毒诊断标准5 lg（CFU/g）的概率分别为10.7%、12.3%、7.1%，且贮藏温度最终污染量/概率分布的相关性最大。因此，依据现有评估和调研结果，若居民购买生菜后全部冰箱7℃贮藏，宝坻基地水培生菜、蓟州基地水培生菜、市售露地大棚生菜中蜡样芽孢杆菌的最终污染量/概率分布可分别100%控制在2.675、2.975、2.625 lg（CFU/g）以下，保障食用安全性。

目前为止，国内外已进行的蜡样芽孢杆菌定量风险评估较少且不完善[9]。即食生菜中蜡样芽孢杆菌的定量风险评估研究尚未见报道且难度较大。由于缺乏蜡样芽孢杆菌的剂量-反应模型，本次评估以105CFU/g作为发生食物中毒的阈值标准[10-11]，同时缺乏生菜中蜡样芽孢杆菌的生长预测模型，本次评估参照肉汤中蜡样芽孢杆菌的生长预测模型和其他即食蔬菜中相关致病菌的生长预测模型进行了假设，因此评估中必然存在一定不确定性[12]。天津市蜡样芽孢杆菌监测仅从部分区域抽检样品，代表性方面存在局限。因此，尽快建立起剂量-反应模型[13]及不同基质中的生长预测模型[14-15]是今后蜡样芽孢杆菌定量风险评估的进一步完善和研究方向。