P16在宫颈上皮内瘤变Ⅱ级组织中的表达及临床意义

张 媛 ，贺桂芳 ，马 莉 ，赵婷婷 ，卞美璐 ，原亚莉 ，杨文艳

（1.北京大学 医学部，北京 100191；2.北京大学 中日友好临床医学院，北京 100029；3.中日友好医院 妇产科，北京 100029；4.中日友好临床研究所 “免疫炎性疾病”北京市重点实验室，北京 100029）

宫颈癌发病率在全球女性肿瘤中位居第三位，在发展中国家位居第二位[1，2]。根据世界卫生组织（world health organization，WHO）估算，全球每年约53万女性发生宫颈癌，约27.5万女性死于宫颈癌。宫颈癌在多数发展中国家，占女性肿瘤死因的第一位[3]。我国宫颈癌每年新发病例约为9.6万例，占世界宫颈癌每年新发病例的18%，其中死亡病例约2.6万[4]。在基线为CINⅠ的患者，p16INK4a阳性与阴性妇女相比，2年后进展为高级别子宫颈病变的风险前者是后者8.25倍，表明p16INK4a的过度表达与宫颈病变程度相关，低级别宫颈病变组织中p16INK4a过度表达能够对其以后进展为高级别宫颈病变具有预测能力[5]。对于CINⅡ具有进展和退化的生物学行为，目前我国尚缺乏确切的方法判断其预后转归。本研究采用免疫组织化学法检测P16表达情况，分析P16蛋白表达与CINⅡ病变进展的关系，为临床采用合理的干预措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2008年1月～2017年12月就诊于中日友好医院，经术后病理报告确诊为宫颈上皮内瘤变（CINⅡ）患者的石蜡组织切片158例。正常宫颈石蜡组织切片40例。患者组织的病理诊断均经2位有经验的病理科医师确诊。

1.2 试剂

抗P16（E6H4）鼠单克隆抗体试剂、新型酶标记物IgG聚合物（上海罗氏制药有限公司）。二氮基联苯胺（DAB）显色试剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。采用Tris-HCl缓冲液来稀释抗P16（E6H4）鼠单克隆抗体试剂。在此产品中没有发现已知的非特异性抗体反应性。

1.3 检测方法

利用免疫组织化学方法进行染色。结果判定：P16INK4A的免疫组织化学判定方法主要有两个方面：表达强度和细胞中表达部位。阳性结果为黄色或棕黄色染色，表达部位是在胞浆和/或细胞核。表达强度参照KLEASR等[6]的半定量标准，按照阳性细胞核所占比例及分布情况记录如下：阴性（-）：单个细胞染色，阳性细胞数＜5%；弱阳性（+）：散在的或小的细胞团染色，阳性细胞数为5%-24%；阳性（++）：片状或簇状细胞染色，阳性细胞数位25%-50%；强阳性：弥漫散的细胞染色，阳性细胞数＞50%。

HPV检测：采用免疫组化技术法，通过发光放大微孔板中基因信号，对受检标本中HPV18，33，45等13种高危型HPV病毒进行检测。检测结果阴性：HPV-DNA负荷量＜1.0pg/ml；阳性：HPV-DNA负荷量≥1.0pg/ml；其中HPVDNA负荷量=标本相对发光单位/标本阳性对照。

LCT检测：清洁宫颈表面黏液，将特制的宫颈细胞刷插入宫颈管内，顺时针在宫颈内旋转5周后快速取出，注入细胞保存液中获取细胞样品，采用TBS系统检测液基细胞。检测结果阳性：ASCH、AGUS/ASCUS、HSIL、LSIL 出现异常或病变。

1.4 统计学方法

所有数据应用SPSS20.0软件包进行统计分析，相关性分析比较患者的术后随访细胞学结果和P16的表达关系，再用秩和检验来比较各组间的差异。

2 结果

2.1 宫颈标本中P16生物标记物表达情况

宫颈标本中P16生物标记物过度表达表现为宫颈鳞状上皮的基底层和基底旁层细胞的弥漫性连续性染色、伴有或不伴有浅表细胞层细胞染色，呈淡黄色至棕褐色，表达强度逐渐增强（见图1，封底）。

图1 A.CINⅡ患者P16阳性表达。B.CINⅡ患者P16阴性表达。（100×）

2.2 P16在正常组织与CINⅡ中阳性表达

对40例正常宫颈组织和158例术后病理确诊为CINⅡ患者的石蜡切片利用免疫组化原理进行染色，观察P16表达情况并进行统计分析。表1示，CINⅡ患者宫颈组织中P16阳性表达率为55.7%，显著高于正常宫颈组织中P16阳性表达率（7.5%，P＜0.01）。

2.3 P16阳性表达与HPV感染的关系

对158例CINⅡ患者中进行HPV感染与P16阳性表达关系的统计分析。随机挑选22例P16阴性的患者中HPV阴性表达为18例，阴性表达率为82%；HPV阳性表达为4例，阳性率18%。随机挑选40例P16阳性表达CINⅡ患者中进行HPV感染的统计。HPV阴性表达为10例，阴性表达率为25%；HPV阳性表达30例，阳性率75%。P16阳性表达与HPV阳性和阴性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）（见表 2）。

2.4 CINⅡ患者阳性表达术后随访结果

表3示，在CINⅡ患者中随机选取37例进行术后随访，P16阳性患者超薄细胞检测（LCT）阳性率72.72%，显著高于P16阴性患者的LCT阳性率（15.79%，P＜0.05）。

表1 P16在正常组织与CINⅡ中阳性表达的统计结果 n（%）

表2 P16阳性表达与HPV感染的关系 n（%）

表3 CINⅡ患者P16阳性表达术后随访结果 n（%）

3 讨论

p16基因是一个多肿瘤抑制基因，主要作用在于能够直接参与细胞周期的调节，抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK4／CDK6的活性，阻止细胞从G1期进入s期[7]。p16基因的失活将导致细胞周期失控，细胞异常增殖而癌变。该基因产物对CDK4的活性具有抑制作用，因而也称为p16 INK4（inhibitor of CDK4）[8]。 P16 的高表达与宫颈癌有一定的相关性，在组织病理学中这一结论已经得到证实[9]。因此P16免疫组化染色已被应用于宫颈癌前病变的辅助诊断，以提高诊断的准确率和可重复性。

有关报道指出，P16在正常组织中表达率为2%，在CIN1中表达率为38%，在CIN2中表达率为68%，在CIN3中表达率为82%[10]。因此P16可以作为宫颈癌上皮内瘤变的一个有效的分子指标。本研究中，P16在正常宫颈组织中阳性率为7.5%；在CINⅡ患者中阳性率为55.7%。P16在正常组织和CINⅡ患者中阳性表达情况具有统计学意义 （P<0.05）。进一步证实了CINⅡ患者中P16表达呈显著正相关，说明P16的高表达促进了宫颈病变的进展。

1977年ZurHausen发现宫颈癌发生的一个重要原因是HPV感染，研究表明由于HR-HPV的E7癌蛋白介导的视网膜母细胞瘤蛋白失活，P16蛋白强烈过度表达[11]。由于E7是HPV相关癌前病变和癌变中维持恶性表型的必要因素，因此P16过度表达与HR-HPV的致癌活性直接相关，并被认为是HPV感染转化的标记物。本研究中P16阳性表达CINⅡ患者中HPV阳性率为75%，阴性率为25%。P16阳性表达与HPV是否感染，两者差异比较有统计学意义（P<0.05），进一步证实了P16过度表达与HPV感染的致病有直接关系。

Roelens等对p16INK4a免疫细胞化学染色与人乳头瘤病毒基因检测HC-Ⅱ对ASCUS和LSIL的分流能力做了荟萃分析，结果发现，p16INK4a预测ASCUS和LSIL进展为高级别子宫颈病变的敏感度分别为83.2%、83.8%，特异度分别为71.0%、65.7%，与HC-Ⅱ相比，两者的敏感度相近，但前者的特异度较高[12]。而我国目前对于宫颈病变存在过度诊治的现象，尤其对CINⅡ的患者；P16对于CIN的诊断有极好的指导作用，可以减少宫颈病变的过度诊治。P16阴性的患者术后随访超薄细胞检测（LCT）阴性表达率为84.21%；阳性表达率为15.79%。P16阳性患者进行术后随访超薄细胞学检测，阴性表达率为27.78%，阳性表达率为72.22%。术后随访超薄细胞学检查与P16阳性和阴性表达两者具有统计学意义 （P<0.05）。可见，P16阳性患者术后病情持续和进展风险更高；P16阴性患者可以采取暂时观察，以减少不必要的手术创伤。

因此，我们认为在CINⅡ级别病变中，P16阳性与阴性妇女对比，未来进展为更高级别子宫颈癌的风险会明显增加，因而P16蛋白可以作为有效的指标指导CINⅡ级别病变的临床治疗。从而建议条件允许的情况下，阴道镜同时行P16检测，阴性表达患者进行观察治疗，阳性表达患者积极采取锥切治疗，采取个体化分流措施以减少生育需求者的创伤。P16染色结果可作为CINⅡ病变转归结局的预警指标，可用于CINⅡ患者随访的分流管理，优化宫颈癌的筛查流程，对于CINⅡ患者干预或随访策略的制定具有指导意义。

4 参考文献