维生素D3辅助治疗儿童重症哮喘可降低血清TLR4、S100β蛋白水平以及延缓哮喘复发①

刘文君 王亚亭 毕良学 梁 磊

(安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥230022)

支气管哮喘(Bronchial asthma,BA)是儿童时期最常见的慢性气道疾病[1]。其中，重症哮喘急性发作尤为紧急，可在数分钟或数小时内出现进行性呼吸困难，造成呼吸衰竭，甚至危及生命[2]。由于儿童中枢神经系统发育尚不成熟，哮喘造成的缺氧可能会对患儿智力、认知功能造成更为严重的后果[3]。大剂量应用糖皮质激素、支气管扩张剂等是临床治疗重症哮喘的常用方法，但仍有部分患儿症状无明显改善。维生素D是人体必需营养物质，除维持血清钙磷浓度的稳定及骨的矿物化等作用外，还具有重要的免疫平衡作用，在呼吸系统中，它可以减轻气道炎症，保护呼吸器官[4]。Toll样受体4(Toll like receptors 4,TLR4)是一种重要的免疫识别受体，在获得性免疫及天然免疫反应中发挥作用。有报道称[5,6]，TLR4的表达可启动和调节气道炎症，在支气管哮喘患者的发病、转归中发挥重要作用。同时，血清TLR4与气道炎症情况有良好的正相关，其水平的高低可直接反映支气管哮喘患者气道的炎症情况。S100β蛋白是钙调蛋白家族中的成员，在中枢神经系统中可影响神经胶质细胞的生长、增殖、分化，并维持钙稳态，对学习记忆等发挥一定作用[7]。有研究证实[8]，由于S100β蛋白生物半衰期仅为2 h，因此，其血清水平可较为及时的反映患者脑损伤的情况，广泛应用于研究新生儿宫内窒息等方面。本研究旨在通过比较重症哮喘患儿使用维生素D3辅助前后的症状、肺功能指标及血清TLR4、S100β表达水平，探讨其治疗效果。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取安徽省儿童医院呼吸科于2015年7月至2016年5月间收治的96例重症哮喘儿童，将其随机分为对照组和观察组，每组48例。诊断标准参照中华医学会儿科学分会呼吸学组于2016年制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[1]。既往均有哮喘反复发作病史，同时排除心功能不全、气管肿瘤等其他可能引起喘息的疾病及有维生素D3应用禁忌者。本研究经安徽省儿童医院伦理委员会批准，并得到参与研究患儿家长的知情同意。

1.2方法

1.2.1治疗方法 所有患儿入院后严格遵循《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》进行哮喘管理，均予以持续性吸氧、止咳、祛痰、平喘及抗感染或解除支气管痉挛等常规治疗。采用支气管舒张剂缓解症状，之后选用糖皮质激素控制气道炎症。期间根据病情控制情况调整治疗方案。观察组在对照组治疗基础上口服维生素D3(厦门国药控股星鲨制药有限公司生产)800 U/d；连续治疗9 d，当患儿症状明显好转时，可继续使用1～2 d。所有患儿于治疗初始及治疗9 d后检查临床治疗效果、肺功能指标及血清TLR4、S100β蛋白水平。

1.2.2观察指标 采用上海涵飞医疗器械有限公司提供的日本美能AS-507 肺功能仪测定患儿肺功能，包括1秒钟用力呼气量占预计值百分比(FEV1)、1秒钟用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、用力呼气25%时瞬间流速(FEF25%)、用力呼气50%时瞬间流速(FEF50%)。所有患儿反复接受测量≥3次，变异率≤5%，取最佳值作为参数记录。分别于治疗前后采集患儿空腹静脉血4 ml，抗凝处理后加入TLR4单抗，在室温下培养15 min；加入红细胞裂解液避光培养10 min，离心操作、去除血清、加入PBS。辅助利用流式细胞仪，测定平均荧光强度值(MFI)，观察TLR4表达的变化。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定S100β蛋白水平(美国RD公司)。同时，对患儿进行1年随访，观察其预后。

2 结果

2.1一般情况比较 本研究共纳入96例重症哮喘患儿。两组男女比例、平均年龄、病程差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2临床症状与体征消失时间 在治疗过程中，两组患儿喘息、气促、胸闷症状、咳嗽和肺内哮鸣音的平均消失时间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1重症哮喘患儿的一般信息表(n=96)

Tab.1Generalcharacteristicsofchildrenwithsevereasthma(n=96)

VariableObservationgroup(n=48)Controlgroup(n=48)PGender[n(%)]0.536Male29 (60.4)26 (54.2)Female19 (39.6)22 (45.8)Age(year,x±s)5.9±3.06.1±2.80.219Course of disease(year,x±s)2.9±1.62.7±1.10.137

Note：Chi-square test for categorical variables and independent samplettest for continuous variable.

2.3两组患儿治疗前后肺功能比较 治疗前，两组患儿肺功能指标FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%较治疗前均显著升高，且观察组上升幅度高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4两组患儿TLR4水平的比较 两组患儿治疗前血清TLR4表达水平无明显差异(P>0.05)；与本组治疗前相比，两组患儿治疗后TLR4的表达降低，差异有统计学意义(图1 A、 B，P<0.05)。与对照组治疗前后相比，观察组患儿治疗前后TLR4有较大程度降低，差异具有统计学意义(图1C，P<0.05)。见图1。

2.5两组患儿S100β水平的比较 两组患儿治疗前血清S100β表达水平无明显差异(P>0.05)。与本组治疗前相比，两组患儿治疗后S100β的表达降低，差异有统计学意义 (P<0.05)。与对照组相比，观察组患儿治疗后S100β水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.6两组患儿哮喘复发时间的比较 Kaplan-Meier法生存分析表明，观察组患儿哮喘平均首发至复发间隔时间(11个月)明显长于对照组的间隔时间(9个月)，差异有统计学意义(log-rank，P<0.05)。见图3。

Clinical signsand symptomsObservationgroup(n=48)Controlgroup(n=48)P1)Respite4.09±1.153.86±1.010.413Shortness of breath4.16±1.273.95±1.08 0.838Chest tightness6.29±2.056.08±1.390.901Cough8.52±2.646.48±2.480.085Intrapulmonary wheezing6.96±2.116.63±1.640.299

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

PulmonaryfunctionObservation group(n=48)BeforetreatmentAftertreatmentDifference betweenbefore treatment andafter treatmentP1)Control group(n=48)BeforetreatmentAftertreatmentDifference betweenbefore treatment andafter treatmentP2)P3)FEV1(L)1.28±0.332.39±0.401.11±0.480.0111.16±0.261.78±0.380.62±0.420.0410.029FEV1/FVC47.76±3.3074.29±5.5226.53±6.110.00252.02±2.7066.73±4.4114.71±5.090.0130.000FEF25%54.53±10.5275.39±11.7510.86±20.890.00754.93±9.4363.10±11.018.17±13.360.0110.038FEF50%44.83±12.0181.26±12.7336.40±19.600.00041.63±13.0170.97±15.5329.34±17.880.0030.041

Note：1)and 2)comparison in lung function between the before and after the treatment among the observation and control group,respectively;3) comparison for the degree changes in lung function between the observation and control group.

图1 两组患儿TLR4水平的比较Fig.1 Level of serum TLR4 in two groups of childrenNote:A.Observation group;B.Control group;C.After treatment in two groups of children (The midline of the box diagram is the median,and the upper and lower sides are quartiles,and the upper and lower lines are 10%-90% quantiles).*.P<0.05.

图2 两组患儿S100β水平的比较Fig.2 Level of serum S100β in two groups of childrenNote:A.Observation group;B.Control group;C.After treatment in two groups of children(The midline of the box diagram is the median,and the upper and lower sides are quartiles,and the upper and lower lines are 10%-90% quantiles).*.P<0.05.

图3 两组患儿哮喘复发时间的比较Fig.3 Comparison of recurrence time of asthma in two groups

3 讨论

哮喘可严重影响儿童的身心健康，也给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担[1]。重症哮喘造成平滑肌痉挛、气道黏膜肿胀、炎性细胞浸润、分泌物渗出增多[9]，可迅速造成严重缺氧与二氧化碳潴留，其中，后面二者可造成患儿脑损伤、认知功能受损[10]。治疗方面，临床上缓解成人重症哮喘的症状常大剂量使用激素、β受体激动剂等，这些治疗方式对儿童存在潜在的副作用，有报道表明，哮喘患儿吸入糖皮质激素对骨龄发育有一定的抑制作用[11]，同时这种对儿童生长的抑制作用不是临时的[12]。因此，提高哮喘患儿的生活质量、改善重症哮喘患儿的预后至关重要。1，25(OH)2D3可通过影响单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞等免疫细胞，调节、平衡免疫功能，发挥广谱抗炎作用，在呼吸系统中，通过影响多种细胞的生长和分化参与气道结构的调节，保护呼吸器官，有研究表明，维生素D3可抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化[13-15]。有研究证实[16]，支气管哮喘患者的肺功能及哮喘控制情况与血清维生素D3的水平有相关性，儿童时期哮喘、上呼吸道感染的发生可能与维生素D3缺乏有关，补充维生素D3水平可降低两者的发病率。TLR4在传导炎症信号的过程中发挥关键作用，其表达可以活化单核-巨噬细胞，释放一系列细胞因子引起炎症反应，从而进行免疫调节。除了参与介导细菌脂多糖导致的细菌性炎症反应外，TLR4还与哮喘、动脉粥样硬化等非细菌性炎症反应有关，因此成为控制炎性反应的靶点[17]。中枢神经系统中的S100β蛋白具有营养神经的作用，可以影响神经胶质细胞的生长，并对学习记忆等发挥一定作用。另有研究证实[8]，血清S100β蛋白水平能及时反应脑损伤，帮助评估缺氧对大脑的损伤情况。本研究可以看出，使用低剂量维生素D3(800 U/d)辅助治疗重症哮喘患儿9 d后，两组患儿治疗后肺功能指标FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%较治疗前均有明显改善(P<0.05)，且观察组肺功能指标改善程度优于对照组(P<0.05)，这与Majak[18]及Tachimoto[19]的研究结果相似。本研究还显示，两组患儿治疗后血清TLR4、S100β蛋白水平较治疗前均降低(P>0.05)，观察组治疗后血清TLR4、S100β蛋白水平低于对照组(P<0.05)，同时，观察组患儿哮喘平均首发至复发间隔时间(11个月)明显长于对照组患儿的9个月(P<0.05)。可以证明维生素D3具有抑制气道炎症、减轻脑损伤、延长复发时间的作用，此作用可能通过抑制肺内炎症因子产生、维持钙磷平衡实现，但具体作用机制尚不明确，同时由于随访时间较短，维生素D3治疗儿童哮喘的机制需要更进一步研究证实。

综上所述，维生素D3辅助治疗儿童重症哮喘可以改善患儿肺功能、抑制气道炎症并减轻哮喘造成的脑损伤，同时能够减缓哮喘的复发时间，从而为治疗儿童重症哮喘提供新思路。