IL-12B 基因rs3212227位点多态性与川崎病及其并发冠状动脉损伤的关联性研究①

谢 圭 杨作成 刘 琳 詹 霞 曾 萍 何艳娟 成 亮 黄利华 陈淳媛

(中南大学湘雅三医院儿科，长沙410013)

川崎病(Kawasaki disease,KD)，又称皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种自限性全身性血管炎，以一系列不明原因的症状和体征为特点。KD主要侵犯中、小动脉，并以冠状动脉损伤为主。流行病学调查显示，KD在各国各地区的发病率呈逐年上升趋势。至今KD发病机制尚不明确，主要涉及遗传、免疫及感染三方面的因素[1]。但为何主要侵犯冠状动脉机制尚不清楚。随着人类全基因组计划的完成，单核甘酸基因多态性与川崎病的相关性亦得到广泛研究。而IL-12B基因 rs3212227多态位点已证实与哮喘、炎症性肠病、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化等多种自身免疫性疾病相关[2-5]。且国内已经有研究表明，其编码产物IL-12p40对KD的发生、发展、对治疗的反应及预后方面可能有一定的影响[6]。但该位点多态性与KD之间是否有关联尚未见报道。本研究对湖南地区IL-12B基因rs3212227位点多态性进行分析，旨在探讨该基因位点多态性与KD及其并发CAL之间是否存在关联。

1 资料与方法

1.1资料 经伦理委员会批准后，父母或其他监护人同意病例下纳入研究对象。实验分对照组和KD组。(1)对照组：86例中国湖南省健康体检的汉族儿童，年龄1岁～7岁，男47例，女39例，排除感染性疾病、心血管疾病、风湿性疾病、肿瘤等，并排除既往KD病史。(2)KD组：选取我院2004年2月～2014年11月期间住院的KD患者83例，其中男51例，女32例，均符合KD诊断标准[7]，所有患儿均为汉族，年龄7个月～7岁，所有患儿入院前均未经丙种球蛋白(IVIG)和阿司匹林治疗，其中KD合并冠状动脉损伤的标准为：年龄≤3岁，冠脉内径>2.5 mm；3岁<年龄≤9岁，冠脉内径>3 mm；9岁<年龄≤14岁，冠脉内径>3.5 mm；②某段血管直径为邻近段的1.5倍及以上；③管壁明显不规则。根据有无冠状动脉损伤分为冠状动脉损伤组(CAL组)和无冠状动脉损伤组(NCAL组)。

1.2方法

1.2.1标本的收集和处理 患儿于入院第1天在其家长或监护人知情同意下，使用一次性采血管(含抗凝剂5%的EDTA-Na2)抽取2 ml静脉血，立即提取DNA或置于-80℃冰箱保存，2月内提取DNA。

1.2.2基因组DNA的提取 应用Promega DNA提取试剂盒，按照说明书要求提取血液基因组DNA，并进行浓度和纯度的测定，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3基因多态性的检测 应用聚合酶链-限制性片段长度多态性技术(Polymerase Chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)，鉴定对照组及KD组IL-12B基因 rs3212227位点基因型。上游引物：5′-GATATCTTTGCTGTATTTGTAT-AGTT-3′；下游引物：5′-AATATTTAAATAGCATGAA-GGC-3′(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。PCR反应体系20 μl：模版DNA(约200 ng)，上下游引物各0.4 μl(20 μmol/L)，2×Taq MasterMix 10 μl，去离子水加至20 μl。扩增反应条件为：预变性95℃、5 min后，95℃、30 s→56℃、30 s→72℃、30 s(35个循环)，终末延伸72℃、10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并于紫外灯下照相，初步鉴定扩增是否成功。随后进行酶切，酶切反应体系如下：25 μl：10 μl PCR产物，TaqⅠ限制性核酸内切酶0.5 μl，buffer 2.5 μl，加双蒸水至25 μl，65℃酶切4 h。酶切产物再次进行电泳及照相，判定基因型，记录结果。随后随机选取鉴定结果为AA、AC、CC基因型各1例，PCR产物送检铂尚生物技术(上海)有限公司以双脱氧链终止法(Sanger法)进行基因测序，以验证酶切结果准确性。

1.3统计学方法 直接计数法计算对照组、KD组IL-12B基因 rs3212227位点基因型以及等位基因频率，采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验受试对象的基因型频率是否符合遗传平衡。采用χ2检验比较对照组与KD组间、NCAL组与CAL组之间基因型及基因频率的差别。以P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床资料 结果见表1。

2.2IL-12B基因rs3212227位点基因PCR产物扩增结果 血液标本提取所得基因组DNA经紫外分光光度仪检测OD260/OD280。比值为1.7～2.0，皆符合实验要求。经PCR扩增得到IL-12B基因rs3212227位点片段为118 bp，与预期一致(见图1)。

2.3PCR产物TaqⅠ核酸内切酶酶切后电泳图 IL-12B rs3212227多态位点呈A-C二态，含C等位基因的DNA片段可被TaqⅠ核酸内切酶识别并酶切，而A等位基因无酶切位点，酶切后AA基因型为118 bp一条片段，AC基因型可被部分酶切为118、92、26 bp三条片段，CC基因型被完全酶切为92、26 bp两条带。因26 bp片段分子量太小，电泳图上难以显示，电泳后，AA基因型呈118 bp一条带，AC基因型呈118、92 bp两条带，CC基因型呈92 bp一条带。结果与预期一致(见图2)。

表1川崎病组临床资料(入院后5d内收集资料)

Tab.1Clinicaldataofkawasakidisease(Alldatawerecollectedwithin5daysafteradmission)

Clinical manifestationCasePercentage(%)Fever83100ESR(ESR>20 mm/h)7691.6Congested or cracked oral mucosa,Strawberry tongue7286.7Changes of limbs7084.3Eye conjunctival congestion6173.5Non-suppurative tumefacion of cervi-cal Lymph node5667.5Polymorphous erythema5467.4CRP(CRP>8 mg/L)5363.9CAL2732.5

2.4直接测序图 见图3。

2.5Hardy-Weinberg平衡吻合度检测 IL-12B基因rs3212227位点基因型频率在对照组、KD组分布经Hardy-Weinberg平衡吻合度检测，χ2值分别为3.25、3.63，P>0.05。具有群体代表性。

图1 IL-12B rs3212227位点PCR扩增产物电泳图Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus IL-12B rs3212227Note:M.DNA Maker;Lane 1-5.The PCR products of locus IL-12B rs3212227 was 118 bp.

图2 IL-12B基因rs3212227位点PCR产物经TaqⅠ酶切后电泳图Fig.2 TaqⅠ enzyme digestion electrophoretogram of locus IL-12B rs3212227 PCR productsNote:M.DNA Maker；Lane 1.Genotype AA had one stripe of 118 bp;Lane 2,3,5.Genotype AC had 2 stripes,118 bp and 92 bp;Lane 4.Genotype CC had one stripe of 92 bp.

2.6对照组及KD组基因型及等位基因频率比较 KD组IL-12B基因rs3212227位点AA、AC、CC基因型频率和A、C等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(χ2分别为4.095、3.316，P>0.05)。NCAL组与CAL组基因型频率和等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=1.586、1.254，均P>0.05)(表2)。

图3 IL-12B 基因rs3212227位点直接测序图Fig.3 Direct sequencing graph of locus IL-12B rs3212227Note:The arrow pointed to the polymorphism of locus rs3212227.A.Genotype AA；B.Genotype AC；C.Genotype CC.

表2各组中IL-12B基因rs3212227位点多态性的分布、基因型及等位基因频率比较

Tab.2Comparisonofpolymorphismdistribution,genotypeandallelefrequencyoflocusrs3212227ofIL-12Bgeneineachgroup

GroupsCaseGenotype[Case(%)]AAACCCAllele[Case(%)]ACControl8630(34.8)48(55.8)8(9.3)108(62.8)64(37.2)KD group8319(22.9)50(60.2)14(16.9)88(53.0)78(47.0)χ24.0953.316P0.1290.069Group NCAL5611(42.3)34(60.7)11(19.6)56(50.0)56(50.0)Group CAL278(29.6)16(59.3)3(10.3)32(59.3)22(40.7)χ21.5861.254P0.4520.263

3 讨论

KD是一种自身免疫性血管炎性疾病，儿童常见并发症是由于损伤冠状动脉所致的心肌梗死及心脏性猝死，其发病机制尚不明确。因此对于能预测其发病及并发症发生相关因素的探讨显得尤为重要。目前研究已发现多个基因多态性可能与KD之间存在相关性[8-15]。IL-12B基因rs3212227位点位于IL-12B的3′非翻译区的3′末端，虽该区域不翻译，但它可影响基因转录的稳定性及mRNA多聚嘌呤的长短，进而影响基因的转录后翻译水平，从而对疾病的发生、发展产生影响。实验研究表明，该位点多态性与血浆IL-12p40水平相关。而IL-12p40可分别与IL-12p35或IL-23p19结合形成IL-12(IL-12p70)或IL-23发挥生物学作用，亦可以单体和(或)二聚体的形式发挥作用。IL-12主要通过调节Th1/Th2间平衡从而在Th1型自身免疫性疾病中处于中心地位[16]；而IL-23主要作用于Th17细胞，在Th17细胞的增殖及稳定中发挥重要作用并能促进相关细胞因子的产生。IL-23具有广泛的生物学活性，特别是在自身免疫性疾病发病过程中起重要作用[17]。研究发现，川崎病急性期患儿血清IL-23及Th17、Th17/Treg水平明显高于稳定期患儿，提示IL-23和Th17细胞可能与川崎病的发病及疾病进展有密切关系[18]。同时IL-12p40可以单体或二聚体形式发挥生物学活性，其功能不仅表现在可竞争性结合IL-12受体从而抑制IL-12的功能，IL-12p40还可作为巨噬细胞化学趋化因子，促进巨噬细胞的迁移。IL-12p40的过表达促进硅肺的形成。IL-12p40的二聚体p80可通过作用于CD8+T细胞促进抑制排斥反应，并与多个病理性炎症反应相关，包括硅肺、移植排斥反应、哮喘，并在分枝杆菌模型中起保护作用[19]。目前IL-12B基因rs3212227位点多态性已经在自身免疫性疾病，如银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病中得到广泛研究[2-5]。川崎病是与免疫有关的血管炎症性疾病，有研究表明，IL-12B的编码产物IL-12p40血浆水平对KD的发生、发展以及对治疗的反应及预后可能有一定的影响[6]，因此，IL-12B基因rs3212227位点多态性可能通过改变IL-12、IL-23及IL-12p40血浆水平及其信号通路，从而在KD的发生发展中起重要作用。

本研究以来自中国湖南的83例KD患儿及86例对照组为研究对象，临床资料显示，KD患儿中冠状动脉损伤27例，发生率为32.5%。本例中冠状动脉损伤发生率远较内蒙古儿童中的调查低，高于重庆医科大学，与北京儿童医院研究相仿，三地报道冠状动脉损伤发生率分别为63.2%、23.8%、36%，内蒙古地区CAL发生率明显较其他地区高，可能是因为，其KD患者大多来自边远地区，缺乏有效的医疗资源，不能得到及时有效地治疗，从而导致其CAL发生率较高。国内外均有研究表明，及时治疗对预防冠状动脉并发症至关重要。本实验中所收集的KD病例，并发CAL相对较低，可能与湖南地区相对较好的医疗环境及资源相关。同时北京及重庆的研究均对冠状动脉损伤做了随访，发现部分冠状动脉损伤发生在KD恢复期[20-22]。本研究中，仅针对住院期间KD患者的冠状动脉损伤情况进行统计，而未进行长期随访，亦可能是本研究冠状动脉损伤发生率低于其他地区的原因，但也不排除遗传及环境因素的影响。另一方面，本实验应用PCR-RFLP方法对IL-12B基因 rs321227位点基因型进行鉴定，但未发现对照组与KD组之间基因型(AA、AC、CC)频率及等位基因(A、C)频率差异存在统计学意义。在NCAL组与CAL组之间该位点基因型频率与等位基因频率差异亦未发现统计学意义。这种结果，可能是因为本研究中仅纳入湖南地区儿童，而不同地区及国家的遗传差异可能导致不同的结论。且本研究纳入病例数相对较少，这也是一个导致结果差异的重大因素。亦有可能IL-12p40对KD的影响并非通过遗传因素或单核苷酸基因多态性产生，又或者并非通过IL-12B基因 rs3212227位点多态性产生影响，也不排除与IL-12B基因其他位点多态性有关等，有待进一步研究。故而该位点与KD发生发展之间是否存在关联性尚需大样本、多中心的临床研究，并对冠状动脉损伤进行长期随访。