TNF-α通过调控KLF4抑制口腔鳞癌细胞CAL27增殖

龚靖淋 唐朝贤 刘一秀 杨 鑫 张玉莲

(重庆大学附属肿瘤医院/重庆市肿瘤研究所/重庆市肿瘤医院，重庆400030)

口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，近年来医学和生命科学取得了高速发展，但患者预后却未得到改善[1]。癌细胞在侵袭之前常常表现为异常基因表达，并在疾病进展过程中分化为间充质细胞样状态[2]。另外，持续地细胞增殖是恶性肿瘤细胞的另一个突出特征。细胞的增殖和分化平衡控制着上皮细胞的发育和稳态，对癌症的病理状态起着决定性的作用[3]。这些细胞过程通常由肿瘤抑制基因调控，而在癌症发展过程中抑癌基因常常处于失活状态，揭示抑癌基因功能作用对于了解口腔癌进展具有重要意义。

近年来研究发现，KLF4是KLF家族中的一个多功能转录因子[4,5]，在细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应、抗病毒免疫等过程中发挥着重要功能[6-9]。包括口腔上皮在内的复层鳞状上皮中，KLF4、KLF5分别在有丝分裂后角化基底细胞和增殖性低分化基底细胞中表达，它们严格控制着上皮细胞的增殖分化平衡[10]。KLFs可通过与靶基因启动子结合进而转录调控靶基因表达，先前研究证实，KLF4表达缺失与口腔癌细胞的去分化相关，并常常在侵袭性口腔癌细胞中低表达[10-12]，表明KLF4表达缺失与肿瘤进展密切相关。研究发现，TNF-α现作为一种具有多种生物学活性的多效性细胞因子能够促进乳腺癌细胞中CD44、KLF4表达进而调控细胞增殖[13,14]，但在口腔鳞癌中TNF癌能否通过KLF4调控细胞增殖仍然未知。

在本研究中，采用不同浓度 TNF-α(0、1、5、10、20 ng/ml)处理口腔鳞癌CAL27细胞24 h，Western blot检测TNF-α对KLF4表达的影响；MTT法分别检测20 ng/ml TNF-α和过表达KLF4对CAL27增殖的影响；沉默KLF4联合TNF-α作用于CAL27细胞，进一步研究KLF4对TNF-α诱导CAL27增殖抑制的影响，旨在揭示TNF-α治疗口腔鳞癌潜能及KLF4表达在口腔鳞癌中的作用，为更有效治疗口腔鳞癌提供新靶点。

1 材料与方法

1.1主要材料 DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)培养基、胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶均购自Gibco公司，TNF-α购自PeproTech公司，KLF4抗体购自Cell Signaling Technology (CST)公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)购自碧云天公司，羊抗兔和羊抗鼠二抗购自北京全式金公司，RNA提取试剂盒RNAiso plus Reagent、RNA逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、qPCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTM均购自TaKaRa，四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)和二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)购自Sigma。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人口腔鳞状细胞癌细胞CAL27购自中科院细胞库，CAL27在添加有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温、5%CO2饱和湿度的培养箱传代培养，取对数期细胞加入0、2.5、5、10、20 ng/ml浓度的TNF-α处理24 h用于提取蛋白进行Western blot实验检测。

1.2.2细胞转染 用RNAiso plus Reagent提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，用特异引物行PCR扩增KLF4 cDNA，并克隆至pcDNA3.1中，构建pcDNA3.1-KLF4载体，用pcDNA3.1空载作为空白对照。KLF4 cDNA扩增引物：F：5-CCTCGAGGACCTTCTGGGCCCCCACATTAATG-3 和R：5-CCGCGG-CCGCACTACGTGGGATTTAAAAGTG-3。KLF4 siRNA(5-AUCGUUGAACUCCUCGGUCUCUCUC-3)购自上海吉玛，用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-KLF4和KLF4 siRNA转染至细胞，进行提取蛋白、mRNA及增殖能力检测。

1.2.3qPCR检测实验 取对数生长期细胞，分离提取总RNA，DEPC水溶解后全波长酶标仪测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录得cDNA，实时荧光定量PCR仪检测KLF4的mRNA相对表达量，以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法来计算KLF4相对表达量。KLF4引物F：5-ACAAAGAGTTCCCATCTCAA-3和R:5-GTAGTGCCTGGTCATTTC-3；GAPDH引物F:5-GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA-3和R：5-ACCTTCCCCATGGTGTCTGA-3。

1.2.4免疫印迹试验(Western blot) 收集处理后细胞，冷PBS洗涤，后重悬于RIPA裂解液，冰上于摇床摇动孵育30 min，裂解完后4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液用BCA法测蛋白浓度，取30 μg 蛋白配成上样缓冲液，经10%SDS-PAGE胶电泳分离、转膜和5%脱脂奶粉封闭后，用KLF4、GAPDH一抗及HRP偶联的二抗进行孵育，ECL曝光液于曝光仪(Bio-Rad)上曝光显影。用Image J软件进行灰度分析，测定KLF4相对表达。

1.2.5MTT检测细胞增殖能力 收集对数生长期细胞，用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基调整细胞浓度为2×104ml-1，每孔200 μl接种于96孔板中，分别于24 h、48 h、72 h时，每孔加入20 μl MTT溶液，继续于细胞培养箱孵育4 h，然后弃上清每孔加入150 μl DMSO，于酶标仪上振荡10 min使结晶充分溶解，测定490 nm处各孔吸光度值。

2 结果

2.1TNF-α对口腔鳞癌细胞CAL27增殖的影响 用20 ng/ml的TNF-α处理CAL27细胞后，MTT检测24 h、48 h、72 h其对细胞增殖的影响，结果发现，与TNF-α(0 ng/ml)组相比，在72 h时TNF-α(20 ng/ml)可显著抑制CAL27细胞增殖能力(P<0.05)(图1)。

2.2TNF-α对口腔鳞癌细胞CAL27中KLF4表达的影响 口腔鳞癌细胞CAL27经不同浓度的TNF-α(0、2.5、5、10、20 ng/ml)处理24 h后，Western blot检测发现，随着TNF-α浓度增加，CAL27细胞中KLF4表达水平呈浓度依赖逐渐增加(P<0.05)(图2A、B)。

2.3构建过表达KLF4的CAL27细胞 为证明TNF-α对CAL27细胞增殖的抑制作用是通过上调KLF4表达介导的，本研究构建了过表达KLF4的CAL27细胞株，经qPCR和Western blot检测发现，与pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-KLF4后CAL27细胞中KLF4的蛋白和mRNA表达均显著增加(0.94±0.06、2.03±0.09，t1=17.454，P1=0.000；1.02±0.11、4.05±0.26，t2=18.590，P2=0.000)(图3)。

2.4过表达KLF4对口腔鳞癌细胞增殖的影响 在CAL27细胞中过表达KLF4后，利用MTT检测过表达KLF4对细胞增殖的影响，结果发现，与pcDNA3.1相比，在48 h、72 h时过表达KLF4可显著抑制CAL27细胞增殖能力(0.51±0.03、0.39±0.02，t48 h=5.765，P48 h=0.005；0.95±0.05、0.56±0.04，t72 h=10.550，P72 h=0.001)(图4)。

图1 TNF-α抑制CAL27细胞增殖Fig.1 TNF-α inhibits proliferation of CAL27 cellsNote: *.P<0.05 compared with TNF-α (0 ng/ml) at 72 h.

图2 TNF-α诱导CAL27细胞中KLF4表达Fig.2 TNF-α upregulated expression of KLF4 in CAL27 cellsNote: A.Western blot was used to detect the expression of KLF4 in CAL27 cells after treating with different concentration of TNF-α;B.The expression level of KLF4 in CAL27 cells after treating with different concentration of TNF-α,*.P<0.05,compard with 0 ng/ml group.

图3 构建过表达KLF4的CAL27细胞Fig.3 Construction of CAL27 cells overexpressing KLF4Note: A.The expression of KLF4 protein in CAL27 was detected by Western blot;B.The relative expression of KLF4 protein and mRNA in CAL27 after transfecting with plasmids;*.P<0.05 compared with pcDNA3.1 group.

图4 过表达KLF4抑制CAL27细胞增殖Fig.4 KLF4 inhibits proliferation of CAL27 cellsNote: *.P<0.05 compared to pcDNA3.1 group at 48 h or 72 h.

图5 沉默KLF4逆转了TNF-α对口腔鳞癌细胞增殖抑制作用Fig.5 Silencing KLF4 reversed the inhibitory effect of TNF-α on proliferation of oral squamous cell carcinomaNote: A.The expression of KLF4 protein in CAL27 was detected by Western blot after transfection of siKLF4;B.The relative expression of KLF4 protein and mRNA in CAL27 after transfecting siKLF4;C.The proliferation of CAL27 cells was detected by MTT;*.P<0.05 compared to Control group,#.P<0.05 compared to TNF-α (20 ng/ml) group.

2.5沉默KLF4逆转了TNF-α对口腔鳞癌细胞增殖抑制作用 为进一步证实，TNF-α是通过上调KLF4表达来发挥促进CAL27细胞增殖作用的，本研究用siRNA沉默KLF4，然后再联合20 ng/ml的TNF-α处理细胞，分别用MTT检测24 h、48 h、72 h时各组细胞吸光值。经qPCR和Western blot检测发现，与Control组相比，转染siKLF4后CAL27细胞中KLF4蛋白和mRNA表达均显著下调(1.26±0.17、0.53±0.04，t1=7.24，P1=0.014；0.99±0.06、0.32±0.07，t2=12.59，P2=0.000)(图5A、B)。MTT实验结果发现，与Control组相比，沉默KLF4可明显促进细胞增殖(P<0.05)；与TNF-α组相比，沉默KLF4联合TNF-α处理可恢复TNF-α对细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。上述结果表明，TNF-α可能部分通过上调KLF4来发挥对CAL27细胞增殖的抑制作用。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌(SCC)是我国常见的致命性恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一[15]。口腔鳞癌的病因包括使用烟草制品、饮酒以及人乳头瘤病毒(HPV)感染等[16]。目前，手术切除联合放化疗是首选治疗策略，但疗效仍不理想，其5年生存率较差[16,17]。迄今为止，已经寻找到了口腔癌的一些分子标记物，但标记物明确的预后或诊断意义尚未确定，因此，寻求新的治疗手段及治疗靶标对于开发新的有效口腔癌治疗策略至关重要[18]。

在肿瘤进展过程中，癌细胞主要通过激活癌基因和/或失活抑癌基因来促进肿瘤恶性进展。据研究报道，KLF4可通过调控细胞周期在细胞转化和细胞增殖中发挥重要作用[16]；在多种类型晚期肿瘤中KLF4表达降低，且其表达丧失可导致癌细胞上皮间质转化，强烈刺激肿瘤恶性进展[18]。最近发现，在高转移胰腺癌细胞中KLF4表达上调，胰腺癌细胞中高表达的KLF4可通过降低p27表达来促进细胞增殖[19]。此外，KLF4在口腔癌中同样具有促癌作用，KLF4可促进口腔鳞癌细胞侵袭[12,20,21]。据研究报道，在低分化和进展期口腔癌中KLF4表达下调并抑制细胞分化[10]。此外，李文文等[20]研究也发现，KLF4对口腔鳞癌细胞增殖有抑制作用。本研究也发现，在口腔鳞癌细胞中过表达KLF4后，细胞增殖能力显著下降，提示KLF4与口腔鳞癌发展有关。

TNF-α作为肿瘤坏死因子在体内具有多种生物学作用，TNF-α在抵抗病原菌感染及抗肿瘤中起着重要作用，是迄今为止抗癌活性最强的细胞因子，但当其超过一定量时便会反过来与其他炎性因子一起促进癌症发生发展及引发多种病理性损伤[21,22]。研究发现，TNF-α在口腔癌患者血清中高表达，且与患者预后有关[23]；TNF-α可调控基质金属蛋白酶促口腔癌细胞侵袭转移[24]。此外，TNF-α也可促进乳腺癌细胞中CD44、KLF4表达进而诱导细胞增殖[13,14]，TNF-α是否能够通过促进口腔鳞癌细胞CAL27中KLF4表达进而促进细胞增殖仍然未知。本研究中我们发现，TNF-α可呈剂量依赖性地促进CAL27细胞中KLF4表达；20 ng/ml的TNF-α处理CAL27可抑制细胞增殖，CAL27细胞过表达KLF4后增殖能力显著降低，而沉默KLF4可部分恢复TNF-α对CAL27细胞增殖抑制作用。综上所述，TNF-α可诱导口腔鳞癌细胞CAL27中KLF4表达增加，KLF4可能参与了TNF-α对CAL27细胞增殖的抑制作用。