甲氨蝶呤对胶原诱导的关节炎小鼠Tfh细胞的影响及其机制研究①

徐 琦 王 龙 顾丹今 伍 婷 任聪改 周 勇 程路峰

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐830011)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种在世界范围内普遍存在的，以全身多个关节滑膜组织炎症和关节退化为主要表现，可致关节畸形或功能丧失的慢性自身免疫性关节疾病[1]。RA的病因及发病机制复杂，滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)是近年来新发现的T细胞亚群[2]，研究表明Tfh与有些自身免疫病病情的严重程度呈现正相关[3]，且该细胞亚群主要辅助B细胞活化、增殖、分化和分泌免疫球蛋白，而大量高亲和力抗体的分泌可诱发炎症反应[4]。Tfh表面表达的CXCR5+和ICOS可促进B细胞分化及记忆B细胞的形成[5]。目前RA的临床治疗原则是缓解疼痛，减轻或缓解炎症的发展,甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作为慢作用抗风湿药，具有免疫抑制与抗炎症的作用在临床上广泛使用[6,7]，但其在治疗过程中对机体Tfh细胞的影响鲜有报道，本研究以胶原性关节炎小鼠模型为基础，研究甲氨蝶呤治疗RA的过程中对Tfh细胞数量表型、功能及转录因子的影响及其作用机制，为临床用药及配伍药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 牛Ⅱ型胶原及完全弗氏佐剂购自Sigma公司；甲氨蝶呤购自江苏恒瑞医药股份有限公司；布洛芬购自山西太原药业有限公司；PE-Cy7标记的CD3抗体、PerCP-Cy5.5标记的CD4抗体、PE标记的CXCR5抗体、FITC标记的ICOS抗体均购自eBioscience公司；ELISA试剂盒购自eBioscience公司；免疫组化抗体购自R&D公司；RNase-Free DNase I、TaKaRa SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ购自天根生化科技有限公司。实验主要仪器有全波段酶标仪、流式细胞仪、荧光定量PCR检测系统；凝胶成像仪、冰冻离心机。

1.2方法

1.2.1CIA实验动物模型的建立及分组 SPF级6周龄雄性BALB/c小鼠40只，体重18～20 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。将40只BALB/c小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组、模型组、MTX组和布洛芬组，每组10只。CIA模型建立按照文献稍加改进[8]。将2 mg/ml的牛Ⅱ型胶原醋酸溶液与等体积CFA充分乳化，配制成 1 mg/ml的胶原乳剂，于小鼠背部、尾根部皮下多点注射胶原乳剂0.1 ml，初次免疫14 d后，在小鼠左后足跖皮下注射0.05 ml进行二次免疫。对照组小鼠于相同部位，采用相同方法注射等量生理盐水。初次免疫第1天起，每日观察踝关节肿胀程度并进行AI评分，记分标准为：0分无关节炎，1分发红或轻微肿胀，2分中度肿胀，3分严重肿胀，4分严重肿胀且不能负重。初次免疫后28 d，各治疗组行药物灌胃治疗，药物剂量如下：甲氨蝶呤1 mg/kg，2次/周；布洛芬18 mg/(kg·d)；对照组：正常饲料喂养；治疗28 d后处死小鼠。

1.2.2免疫组化检测 组织包埋：摘眼球取血后处死小鼠。取脾脏进行测量记录后，10%多聚甲醛固定、石蜡包埋连续切片，厚度为4 μmol/L，进行免疫组化染色。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。结果以随机检测5个视野下阳性面积比，为每个视野中阳性细胞面积占整个视野面积的百分率，取其平均值，作为CXCR5的阳性密度。

1.2.3酶联免疫吸附实验 外周血3 500 r/min离心20 min，分离上层血清，按照ELISA试剂盒操作步骤进行细胞因子IL-21和IL-6的检测。特异性抗体包被酶标板，4℃过夜，加封闭液封闭非特异性结合位点后加标准品及待检血清，孵育2 h后洗涤加入相应酶标二抗，孵育1 h后洗涤，加入底物、显色剂。酶标仪检测450 nm/620 nm处的光密度值。

1.2.4流式细胞术 取小鼠脾细胞悬液进行荧光抗体染色：1×106细胞中分别加入PE-Cy7标记的CD3抗体、PerCP-Cy5.5标记的CD4抗体、PE标记的CXCR5抗体、FITC标记的ICOS抗体进行荧光抗体染色，室温孵育20 min,洗涤后重悬细胞；加每个样品均设同型对照。样品管置于流式细胞仪上检测。

1.2.5RT-PCR Trizol提取脾脏组织总RNA，逆转录-聚合酶链反应检测组织中转录因子Bcl-6和IL-21 mRNA表达水平，采用引物如下：Bcl-6上游引物:5′-CGTGAGGTCGTGGAGAACAAT-3′，下游引物：5′-ATGGGATAAGAGGCTGGTGGT-3′；IL-21上游引物:5′-CTATTTTCCCTGGAGTGGTATCA-3′,下游引物：5′-TGCTATCTTAGGGCGGTACAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。用凝胶成像系统行光密度扫描半定量，与GAPDH 密度扫描值之比，作为评价 mRNA 相对表达量的指标。

2 结果

2.1CIA小鼠关节AI评分 模型组小鼠免疫28～35 d 炎症反应达到高峰期，关节局部出现肿胀充血，皮温升高，足垫增厚，部分小鼠关节活动受限。35 d 后，模型组小鼠的AI评分逐渐呈下降趋势。MTX组和布洛芬组小鼠在给药后16 d开始，关节肿胀程度显著低于模型组(P<0.05)，但两治疗组间无明显差异。给药后28 d，MTX组和布洛芬组小鼠关节肿胀程度较模型组明显减轻，其差异具有统计学意义(P<0.05)，其中以布洛芬的作用更为显著，见图1。

2.2脾脏组织中CXCR5+Tfh细胞数量及表型的变化 免疫组化结果显示，模型组小鼠脾脏中CXCR5+细胞阳性密度显著高于正常对照组，组间差异有统计学意义(P<0.01)，且CXCR5在脾小结的表达密度显著增加。与模型组比较，MTX组及布洛芬组CXCR5+细胞密度明显减少，尤其是脾小结中的阳性细胞数显著降低，其差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

流式细胞术结果显示，模型组脾脏中CD4+CXCR5+Tfh细胞数量较对照组显著升高，且Tfh细胞上的ICOS表达已显著性升高，其差异具有统计学意义(P<0.05)。MTX组及布洛芬组脾脏中CD4+CXCR5+Tfh细胞数量较对照组显著升高，差异具有统计学意义，但与模型组相比Tfh细胞及活化分子ICOS的表达显著下降，其差异具有统计学意义(P<0.05)；见图3。

图1 大鼠关节炎评分情况Fig.1 Arthritis index of different group in CIA miceNote:*.P<0.05 vs model group；**.P<0.01 vs model group.

图2 CXCR5在各组小鼠脾脏中的表达Fig.2 Expression of CXCR5 in mouse spleenNote:A.Control group;B.Model group;C.Methotrexate group;D.Ibuprofen group.

图3 脾脏中Tfh细胞的表达Fig.3 Expression of Tfh cell in mouse spleen

2.3血清细胞因子IL-21和IL-6含量的变化 与模型组相比，MTX组及布洛芬组小鼠血清IL-21 及IL-6水平明显下降(P<0.05)；其中以布洛芬组血清细胞因子降低最为显著(P<0.01)，治疗组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4脾脏中转录因子Bcl-6及IL-21 mRNA的表达 模型组、MTX组和布洛芬组小鼠脾脏中转录因子Bcl-6的相对表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)，其中MTX组Bcl-6相对表达量与模型组相比有所升高，其差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠脾脏中转录因子IL-21的相对表达量与对照组相比显著升高(P<0.05)，而MTX组与布洛芬组小鼠IL-21的相对表达量与模型组及对照组相比均显著降低，其差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

表1血清中细胞因子的含量(pg/ml，n=10)

Tab.1Concentrationofcytokinesinserum(pg/ml，n=10)

GroupsIL-21IL-6Control18.61±4.2821.41±1.34Model40.49±3.121)58.36±3.381)Methotrexate32.11±6.061)2)40.56±2.931)2)Ibuprofen27.84±3.971)3)36.82±4.111)3)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group;3)P<0.01 vs model group.

图4 各组小鼠脾脏中Bcl-6 及IL-21 mRNA的表达Fig.4 Expression of Bcl-6 mRNA and IL-21 mRNA in mouse spleenNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

3 讨论

RA是一种以关节滑膜炎为主要特征的常见慢性、进行性自身免疫性疾病,其病因及发病机制尚不完全明确，有大量证据表明Treg/Th17细胞亚群失调、两类细胞分化及功能相关的细胞因子TNF-α、IL-6及IL-17表达异常与RA的病情密切相关。Tfh是近年来新发现的T细胞亚群，表型为CD4+CXCR5+ICOS+，主要分布于淋巴滤泡 GC内[9],其主要功能是辅助B细胞参与体液免疫，并能促进GC的形成，在Ig类别转换等方面也发挥关键作用。研究认为Th细胞在转录因子B细胞淋巴因子-6(B-cell lymphokine-6，Bcl-6)调控下，可分化为Tfh细胞，该细胞的关键特征是细胞膜表面持续表达CXCR5并分泌IL-21[10,11]。其表面表达的CXCR5+是Tfh 迁移、定位重要的转运分子,该分子使Tfh在 CXCL13趋化下，募集到淋巴滤泡促进与B细胞的相互作用。IL-21是Tfh细胞主要功能分子，其与IL-6作用可影响转录因子Bcl-6 mRNA的表达及Tfh的分化；此外,IL-21与表面分子ICOS还共同参与了调节 B 细胞的分化，成熟以及Ig类别转换。因此，Tfh细胞数量及相关分子表达异常可能与多种抗体介导的自身免疫性疾病发生、发展有关[12,13]。

甲氨蝶呤是临床上应用广泛的慢作用抗风湿药，其具有免疫抑制与抗炎症的作用[14]。本研究在成功建立CIA小鼠模型的基础上，探讨了甲氨蝶呤对CIA小鼠Tfh细胞的影响及其机制。研究结果显示，CIA模型小鼠脾脏中Tfh细胞数量和表型发生变化：Tfh细胞数量显著增加，且广泛分布于脾小结中心区域；且Tfh中ICOS的表达量进一步增加。同时脾脏中转录因子IL-21的相对表达量及血清中IL-21和IL-6水平较对照组相比显著升高，提示在RA发病中细胞因子IL-21可能通过促进Tfh 的增殖，分化影响疾病的发生发展。甲氨蝶呤能有效缓解CIA小鼠关节的肿胀程度，使脾脏组织中的Tfh细胞数量减少，尤其是促进了脾小结中Tfh细胞数量的显著降低，且细胞表型中ICOS的表达量较模型组显著降低。同时与模型相比甲氨蝶呤能显著降低脾脏中转录因子IL-21的相对表达量及血清中IL-21和IL-6水平，以上结果提示甲氨蝶呤可能通过抑制转录因子IL-21的表达，降低血清中IL-21、IL-6的水平来影响机体Tfh细胞的数量、表型，及在脾小结中的分布来达到影响B细胞的分化及功能，从而减轻炎症反应。在RT-PCR结果中CIA模型组脾脏转录因子Bcl-6的相对表达量与实验预期有所不同，与对照组相比显著降低，该结果与Tfh细胞在脾脏中数量增多不相吻合，同时甲氨蝶呤治疗组Bcl-6的相对表达量与模型组相比有所升高，这可能与Tfh的分化涉及多因素有关，具体机制还要通过实验进一步的分析确证。

综上所述，本研究结果表明，甲氨蝶呤可减轻CIA小鼠的关节肿胀程度，具有一定的抗炎作用，其作用机制可能是通过影响转录因子IL-21、血清细胞因子IL-21和IL-6表达水平，调节Tfh的数量及表型和分布，进而影响B细胞的分化及功能。本研究初步探讨了甲氨蝶呤在治疗RA中对Tfh的影响，为临床进一步寻找治疗RA的新策略及合理处方用药提供了理论依据。