血管生成素抑制雄激素性秃发区毛乳头细胞中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白表达的研究

2018-10-12周乃慧李艳朱月倩任孙王淼淼刘铭

中华皮肤科杂志 2018年9期

周乃慧李艳朱月倩任孙王淼淼刘铭

215006苏州大学附属第一医院皮肤科

已有研究证实，毛囊及毛囊周围组织纤维化是导致雄激素性秃发中毛囊微型化的重要原因[1⁃2]。血管生成素是一种毛囊起源的血管生成因子，在体内外均有促进毛发生长的作用，其机制可能与诱导皮肤血管形成及促进毛乳头细胞增殖有关[3⁃5]，而血管生成素是否能抑制雄激素性秃发区毛乳头细胞中细胞外基质成分如Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达尚未见报道。本研究探讨血管生成素对体外培养的雄激素性秃发区毛乳头细胞中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白表达的影响及其可能的作用机制。

材料与方法

一、材料

1.组织来源：人顶部头皮取自苏州大学附属第一医院皮肤科门诊因色素痣、皮脂腺痣或疣状痣行手术切除的周围正常头皮组织，共10份。患者年龄30～45岁，均为男性，符合雄激素性秃发的诊断标准[6]，秃发严重程度为Hamilton⁃Norwood 分级Ⅱ～Ⅲ级，且1年内未用过影响毛发生长的药物，包括非那雄胺、米诺地尔溶液、生发中药、降压药物及糖皮质激素等。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.主要试剂与仪器：血管生成素（美国R&D公司），L谷氨酰胺、分离酶、胰蛋白酶、胶原酶和胎牛血清（美国Gibco公司），Dulbecco Modified Eagle Media（DMEM，美国Hyclone公司），总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，CCK8试剂盒[东仁化学科技（上海）有限公司]，二氢睾酮（美国Sigma公司），兔抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗人纤维连接蛋白单克隆抗体、兔抗人转化生长因子β1（TGF⁃β1）单克隆抗体、兔抗人p⁃Smad2（磷酸化位点为S255）单克隆抗体、兔抗人p⁃Smad3（磷酸化位点为S423和S425）单克隆抗体、兔抗人β肌动蛋白单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（美国Abcam公司）。

二、方法

1.人毛乳头细胞培养：采用改良两步酶消化法[7]分离人毛乳头。分离得到的毛乳头以DMEM（含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素）悬浮后接种于6孔培养板，待2～3周细胞大部分生长融合后，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.实时荧光定量PCR检测不同传代次数毛乳头细胞中雄激素受体mRNA的表达：分别收集对数生长期第1～6代毛乳头细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并反转录合成cDNA。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，雄激素受体正向引物 5′⁃ACAGGAGGAAGGAGAGGCTT⁃3′，反向引物5′⁃GTTGTTGTCGTGTCCAGCAC⁃3′，扩增产物160 bp。β肌动蛋白正向引物5′⁃GTCATTCCA AATATGAGATGCGTTG⁃3′，反向引物5′⁃GCTATCA CCTCCCCTGTGTG⁃3′，扩增产物121 bp。PCR反应体系：cDNA 1 μl，2 × SYBR Green Mix 10 μl，正向引物及反向引物各0.5 μl，DEPC水8 μl，总体积20 μl。PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环。反应结束后，在ABIPrism SDS软件上查看基因的扩增情况，导出阈值循环数（Ct）。以β肌动蛋白为内参照，雄激素受体为目的基因，第1代毛乳头细胞为对照组，以2⁃△△Ct计算目的基因mRNA的相对表达量，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct。

3.CCK8法检测细胞增殖：取生长融合的第1代毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml接种于96孔板，每孔100 μl，待细胞贴壁后换用无血清DMEM，根据预实验结果，分别加入0、10、20、40、80、160 μg/L血管生成素，每个浓度再分为2个亚组，分别加入0、0.1 nmol/L二氢睾酮，每组6个复孔。血管生成素及二氢睾酮按照产品说明书储存与操作，以维持其生物学活性的稳定。培养48h后，按照CCK8试剂盒说明，每孔加入CCK8试剂10 μl，继续孵育3h，酶标仪下测定450 nm波长处吸光度（A450）。以A450代表细胞增殖活性。

4.实时荧光定量PCR和Western印迹检测Ⅰ型胶原基因、纤维连接蛋白、TGF⁃β1 mRNA和蛋白以及p⁃Smad2和p⁃Smad3蛋白表达：取生长融合的第1代毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml接种于6孔板，每孔2ml，待细胞贴壁后，换用无血清DMEM，实验分为3组，分别为不含二氢睾酮及血管生成素的对照组、0.1 nmol/L二氢睾酮组、0.1 nmol/L二氢睾酮+80 μg/L血管生成素组，每组3个复孔。培养48h后，①提取细胞总RNA并反转录合成cDNA，Ⅰ型胶原基因正向引物：5′⁃GTGCTC GTGGAAATGATGGT⁃3′，反向引物：5′⁃CATTGGCAC CTTTAGCACCAG⁃3′，扩增产物243 bp。纤维连接蛋白正向引物：5′⁃AGTACGGCCACCAAGAAG T⁃3′，反向引物：5′⁃ATCTCCCTCCTCACTCAGCT⁃3′，扩增产物 227 bp。TGF⁃β1 正向引物：5′⁃GCAACAATTCCTGGCGATACC⁃3′，反向引物：5′⁃TAGTGAACCCGTTGATGTCC⁃3′，扩增产物198bp；β肌动蛋白引物序列、PCR反应体系及反应条件见方法2；β肌动蛋白为内参照，以2⁃△△Ct计算目的基因mRNA的相对表达量，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct；②Western印迹检测Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、TGF⁃β1、p⁃Smad2和p⁃Smad3蛋白的表达：收集细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，总蛋白40 μg上样、电泳、转膜及封闭。加入一抗[兔抗人Ⅰ型胶原（1∶500）、纤维连接蛋白（1∶800）、TGF⁃β1蛋白（1∶1 000）、p⁃Smad2（1∶1 000）、p⁃Smad3（1∶500）、β 肌动蛋白（1∶2 000）单克隆抗体]，4℃孵育过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体滴度1∶5 000）37℃孵育1h，洗膜、显影，并用ImageJ对蛋白条带进行灰度分析，以目的蛋白与内参β肌动蛋白条带的灰度比值作为目的蛋白相对表达水平。

结果

一、雄激素受体mRNA在不同传代次数毛乳头细胞中的表达

第1～6代雄激素性秃发区毛乳头细胞中，雄激素受体mRNA的表达水平（2-△△Ct）逐渐减少，分别为1.000± 0.000、0.675± 0.021、0.392± 0.042、0.045±0.003、0.021± 0.001、0.005± 0.000，各代间差异有统计学意义（F=1365.392，均P＜0.01），第6代毛乳头细胞表达量仅为第1代的1/200。

二、血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞增殖的影响

在不加二氢睾酮组，不同浓度血管生成素作用48h后，与对照组相比，20～160 μg/L血管生成素能明显促进毛乳头细胞增殖（均P＜0.05），其中以80 μg/L血管生成素促进增殖作用最为显著（P＜0.05）。在同一浓度血管生成素作用下，含二氢睾酮组毛乳头细胞增殖均明显低于不含二氢睾酮组（均P＜0.05）。在二氢睾酮作用下，与对照组相比，20～160 μg/L血管生成素能够促进毛乳头细胞增殖（均P＜ 0.05），其中以80、160 μg/L血管生成素促进毛乳头细胞增殖的作用最为显著（均P＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度血管生成素作用48h后毛乳头细胞增殖活性比较（A450，±s）

注：n=6。a～e分别示与同一亚组对照组、10～80 μg/L血管生成素组相比，P＜0.05

血管生成素0（对照组）10 μg/L 20 μg/L 40 μg/L 80 μg/L 160 μg/L F值P值二氢睾酮0 0.263±0.004 0.266±0.004 0.275±0.003a b 0.295±0.003a b c 0.334±0.003a b c d 0.328±0.004a b c d e 476.309＜0.01 t值0.1 nmol/L 0.186±0.003 0.188±0.004 0.194±0.002a b 0.245±0.004a b c 0.284±0.003a b c d 0.286±0.002a b c d 1 478.716＜0.01 39.384 36.008 52.379 24.495 29.084 22.207 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

三、血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞Ⅰ型胶原基因、纤维连接蛋白和TGF⁃β1 mRNA表达的影响

与对照组相比，二氢睾酮能够显著上调毛乳头细胞中Ⅰ型胶原基因、纤维连接蛋白和TGF⁃β1 mRNA的表达（均P＜0.05）。与二氢睾酮组相比，二氢睾酮+血管生成素组Ⅰ型胶原基因、纤维连接蛋白和TGF⁃β1 mRNA的表达明显减少（均P＜0.05）。见表2。

表2 血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞中Ⅰ型胶原基因、纤维连接蛋白及TGF⁃β1 mRNA（2⁃△△Ct）相对表达水平的影响（±s）

注：n=3。a与对照组相比，P＜0.05；b与二氢睾酮组相比，P＜0.05。TGF⁃β1：转化生长因子β1

组别对照组二氢睾酮组二氢睾酮+血管生成素组F值P值Ⅰ型胶原基因1.000±0.000 4.329±0.165a 1.563±0.143a b 597.669＜0.01纤维连接蛋白1.000±0.000 2.156±0.115a 1.290±0.063a b 187.907＜0.01 TGF⁃β1 1.000±0.000 1.707±0.100a 1.136±0.098b 64.259＜0.01

四、血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、TGF⁃β1、p⁃Smad2及p⁃Smad3蛋白表达的影响

与对照组相比，二氢睾酮能够显著上调毛乳头细胞中Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、TGF⁃β1、p⁃Smad2及p⁃Smad3蛋白的表达（均P＜0.05）。与二氢睾酮组相比，二氢睾酮+血管生成素组Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、TGF⁃β1、p⁃Smad2及p⁃Smad3蛋白的表达均减少（均P＜0.05）。见图1、表3。

图1 Western印迹检测血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白等蛋白表达的影响 1：对照组；2：二氢睾酮组；3：二氢睾酮+血管生成素组

表3 血管生成素对雄激素性秃发区毛乳头细胞Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、TGF⁃β1等蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。以目的蛋白与β肌动蛋白条带的灰度比值作为目的蛋白相对表达水平。a与对照组相比，P＜0.05；b与二氢睾酮组相比，P＜0.05。TGF⁃β1：转化生长因子β1

组别对照组二氢睾酮组二氢睾酮+血管生成素组F值P值Ⅰ型胶原0.188±0.005 0.416±0.014a 0.184±0.006b 588.536＜0.01纤维连接蛋白0.092±0.001 0.151±0.004a 0.096±0.003b 271.000＜0.01 TGF⁃β1 0.177±0.003 0.314±0.011a 0.177±0.005b 385.609＜0.01 p⁃Smad2 0.108±0.006 0.238±0.003a 0.116±0.001b 1 026.987＜0.01 p⁃Smad3 0.119±0.005 0.227±0.002a 0.099±0.003a b 1 260.542＜0.01

讨论

在雄激素性秃发的实验研究中，一直缺乏理想的动物模型和生物学性状稳定的毛乳头细胞株[8]。我们利用外科手术后雄激素性秃发区的头皮组织，成功分离与培养了原代毛乳头细胞。由于二氢睾酮需与毛乳头细胞的雄激素受体结合后才能发挥生物学活性，但本实验结果显示，体外培养的雄激素性秃发区的毛乳头细胞随着传代次数的增加，雄激素受体mRNA的表达量明显降低，至第6代其表达量仅为第1代的1/200，这与既往文献报道相似[9]。为克服毛乳头细胞传代次数增加后雄激素受体低表达对体外实验的影响，本研究选择第1代融合生长的毛乳头细胞传代后用于实验。细胞增殖实验发现，0.1 nmol/L二氢睾酮能够明显抑制雄激素性秃发区毛乳头细胞增殖，20～160 μg/L血管生成素则能明显拮抗二氢睾酮抑制毛乳头细胞增殖的作用，其中以80和160 μg/L血管生成素的作用最为明显。

毛囊及毛囊周围组织的纤维化与雄激素性秃发的发病及严重程度密切相关，其中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白是介导毛囊及毛囊周围组织纤维化的两种主要细胞外基质成分[10⁃12]。本研究中实时荧光定量PCR及Western印迹结果显示，0.1 nmol/L二氢睾酮能够明显促进雄激素性秃发区毛乳头细胞中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达，80 μg/L血管生成素则能够明显拮抗由二氢睾酮诱导的Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。目前认为，TGF⁃β1是调控雄激素性秃发中毛囊及毛囊周围组织纤维化的关键细胞因子，二氢睾酮作用于毛乳头细胞后，诱导TGF⁃β1表达增加，TGF⁃β1与其受体结合后形成TGF⁃β1/TGF⁃βRⅠ/TGF⁃βRⅡ复合物，进一步磷酸化Smad2和Smad3，活化TGF⁃β1/Smad信号通路，最终引起与纤维化相关的目的基因包括Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白等的转录[12⁃15]。我们进一步研究发现，0.1 nmol/L二氢睾酮能够明显促进雄激素性秃发区毛乳头细胞中TGF⁃β1 mRNA和蛋白表达，同时加入80 μg/L血管生成素作用后，TGF⁃β1 mRNA和蛋白表达均明显降低，且p⁃Smad2和p⁃Smad3蛋白表达亦明显减少。

综上所述，血管生成素在体外能抑制雄激素性秃发区毛乳头细胞中细胞外基质成分Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达，其机制可能与下调TGF⁃β1表达及抑制TGF⁃β1/Smad信号通路的活化有关。由于毛囊及毛囊周围组织纤维化对雄激素性秃发的发生与发展起重要作用，如果以血管生成素为靶分子，筛选能够上调血管生成素表达的外用药物，抑制或延缓纤维化的过程，将有望为临床上治疗雄激素性秃发提供新的思路。