新疆汉、维、哈族帕金森病患者必需氨基酸相关性研究

李 婕， 刘远新， 陈军虎， 王新亭， 沙迪克·买合不热提， 茹克亚

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以中脑黑质致密部多巴胺能神经元退行性病变为主要病理特征的中枢神经系统退行性疾病，仅次于阿尔茨海默病成为第二大老年退行性疾病。震颤、肌强直及运动减少为该病的主要临床表现，本病病因及发病机制尚不明确，目前主要考虑与遗传、环境、饮食、年龄[1，2]等因素有关。主要的发病机制为线粒体功能紊乱[3]、神经炎症及氧化应激[4]等。而当前就帕金森病与兴奋性氨基酸相关性研究是国际研究热点之一，主要集中在谷氨酸、天门冬氨酸等对中枢神经系统细胞兴奋性毒性以及抑制性氨基酸中最为重要的递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)在患者脑组织中含量变化等方面上[5，6]。然而就人体生长所必需的参与蛋白质构成的氨基酸与本病的关系却研究甚少。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究对象均来自新疆各地州医院神经内科2012～2016年收治的门诊或住院帕金森病患者共960例，其中汉族帕金森病患者168例，对照组198例，维族帕金森病患者144例，对照组181例，哈族帕金森病患者108例，对照组161例，对照组为同期各地州医院体检中心以及其他科室收住人员，每一位对照组患者为随机抽取，与病例组年龄(±3岁)、族别、性别、职业、文化程度与PD患者相匹配的无帕金森病的符合本研究对照组纳入标准者，在经患者本人同意后纳入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 采集方法 研究对象均于入院空腹10 h后，次日晨抽空腹肘静脉血2 ml，置于促凝管中，于室内常温下以3000 r/min的速率离心15～20 min，将血清置于EP管中-80 ℃冰箱内保存，待测。

1.2.2 样品处理 定性分析8种必需氨基酸标准品：在玻璃试管中依次加入1 ml乙腈，500 μl无水乙醇，5 μl内标，然后加入500 μl血清；用漩涡混匀器混匀1 min，然后以 3000 r/min 的速率离心10 min，取上清液与另一试管内；加入20 μl氢氧化钠溶液使其碱化；加入1000 μl正己烷萃取两次；加入50 μl氯甲酸乙酯、100 μl 吡啶后混匀30 s释放CO2；加入氯仿625 μl，缓冲溶液1.25 ml，加盖混匀2 min，静止至上层液澄清；吸取下层液，并加入约5 μl无水硫酸钠，静止30 s；吸取液体移入EP管中，在氮吹仪下浓缩至80～100 μl，进行进样分析。

1.2.3 色谱条件 选用 GC6890气象色谱仪，色谱柱为 DB-17MS，前检测器尾吹气流量15 ml/min，前进样口总流量18.4 ml/min，前进样口压力90 kPa，前进样口温度、柱箱温度 280 ℃，前检测器氮气流量30 ml/min。

1.3 统计学方法 所收集数据通过Excel录入建立数据库，两样本均数比较采用独立样本t检验；计量资料以均数±标准差；多组计量资料比较前进行方差齐性检验，若符合方差齐性，采用单因素方差分析方法进行组间两两比较，并以LSD法行多重比较，检验水准=0.05；若方差不齐性，采用Games-Howell近似检验，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 必需氨基酸检测标准 本次实验测得的人体8种必需氨基酸(缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、苏氨酸Thr、甲硫氨酸Met、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lsy、色氨酸Trp)标准品色谱图(见图1)；8种必需氨基酸在气相下的保留时间、峰面积、内标面积及标准品峰面积/内表面积(=该氨基酸的血清相对含量)(见表1)。

2.2 不同民族病例组与对照组必须氨基酸含量比较

2.2.1 汉族病例组于对照组8种必需氨基酸含量比较 见表2。此次所收集病例中，汉族病例组168例，对照组198例，比较两组必须氨基酸含量，可得出两组在缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸含量存在统计学差异(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.2 维吾尔族病例组与对照组8种必需氨基酸含量比较 见表3。此次所收集病例中，维吾尔族病例组144例，对照组181例，比较两组必须氨基酸含量，可得出两组在异亮氨酸、甲硫氨酸的含量存在统计学差异(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.3 哈族病例组与对照组8种必需氨基酸含量比较 见表4。此次所收集病例中，哈族病例组108例，对照组161例，比较两组必须氨基酸含量，可得出两组在缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸含量存在统计学差异(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.4 3个民族对照组8种必需氨基酸含量的比较 见表5。

2.2.5 3个民族病例组8种必需氨基酸含量的比较 见表6。

图1 8种必需氨基酸标准品色谱图

氨基酸保留时间峰面积内标面积标准品面积/内标面积缬氨酸亮氨酸异亮氨酸苏氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸赖氨酸色氨酸内标10.88411.72311.91612.84615.48416.75421.41325.36618.8844.65690.55538.31750.03480.14565.047183.511208.249113.282136.16899.047144.361153.46370.65727.83619.3370.3940.6650.3870.3470.5220.9216.59310.769

注：标准品峰面积/内标面积=该氨基酸的血清相对含量

表2 汉族病例组与对照组在8种必须氨基酸含量比较

表3 维吾尔族病例组与对照组在8种必须氨基酸含量比较

表4 哈族病例组与对照组在8种必须氨基酸含量比较

表5 3个民族对照组在8种必须氨基酸含量的比较

注：两两比较中，亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸含量均存在统计学差异(P<0.05)

表6 3个民族病例组在8种必须氨基酸含量的比较

注：两两比较中，色氨酸含量均存在统计学差异(P<0.05)

3 讨 论

氨基酸在人体生长、发育过程中起着不可或缺的作用。自然界中已发现的天然氨基酸多达300余种，而人体生长、发育过程中参与蛋白质构成的仅有22种。按照人体自身合成能力可以分为非必需氨基酸、条件必需氨基酸及必需氨基酸，那些人体自身不能合成或合成速度远不能适应机体代谢需要我们称之为必需氨基酸，包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸。必需氨基酸是合成生物大分子蛋白质、参与机体新陈代谢，促进生命稳态所必须的。人体内的任何一种必需氨基酸都只能以一定的数量和比例参与生物活动，过量或不足均会造成人体所需氨基酸之间失衡，甚至会产生体内负氮平衡，长期的氨基酸失衡饮食会影响到营养蛋白质合成、机体的生理机能，导致代谢紊乱、抵抗力下降等[7，8]。新疆自古以来就是多民族聚居地方，前三大民族分别为汉、维、哈族，3个民族自古以来就有着不同的民族风俗、饮食居住习惯。刘燕等[9]就新疆地区不同民族间帕金森病患病率的流行病学调查研究中得出，新疆喀什地区6229例55岁以上的汉族、维吾尔族中老年人调查结果显示，调查人群中汉族的PD患病率为0.7%(21/2871)，维吾尔族的PD患病率为1.1%(36/3274)。而杨新玲等[10]对伊犁地区5113例进行流行病学问卷调查，其中总患病率为1.2%，其中哈族、汉族和维族PD患病率为1.2%、1.1%和1.5%。因此检测汉、 维、哈族帕金森病患者血清必需氨基酸含量对临床和科研等都具有重要意义。

此次试验可得出，3个民族的病例组与对照组在甲硫氨酸含量上均有差异，而3个民族病例组在八种必须氨基酸含量的比较来看两两比较色氨酸含量的差异均有意义。

甲硫氨酸(methionine，Met)是一种人体必需氨基酸，即人体自身不能合成，只能通过食用动植物类蛋白由外界间接获得。甲硫氨酸在维持人体生长发育方面起着不可或缺的重要作用，同时他还具抗氧化作用[11，12]。而其中间代谢产物同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)与本病的关系，较多研究认为PD患者拥有较高的高同型半胱氨酸，但在后来的研究中人们逐渐认识到PD患者血浆同型半胱氨酸水平升高可能为左旋多巴在体内代谢所致[13，14]. Yasui等对20例日本籍PD患者在接受左旋多巴治疗前后tHcy水平的研究中，同时测定其MTHFR基因型，研究结果提示左旋多巴治疗后患者血浆Hcy水平有明显升高，同时发现患者 Hcy 升高的程度与 MTHFR 基因型有关，因此有理由认为帕金森病患者血浆同型半胱氨酸水平过高是服用左旋多巴药物所引起的，而MIHFR基因型会影响其升高的水平[15]。而体内甲硫氨酸含量的锐减可导致机体激素、神经递质、蛋白质等因缺乏甲基而间接导致了帕金森病患者诸如抑郁、便秘等某些临床不适兼症。此次研究可看出3个民族病例组甲硫氨酸检测水平明显低于对照组，可得出甲流氨酸的减少是该病发生发展的因素之一，也提示帕金森病患者在饮食上要注意补充适量甲硫氨酸。

色氨酸(Tryptophan，TRP)是一种人体必需氨基酸，在体内主要经犬尿氨酸(kynurenine，KYN)途径代谢，其中间产物KYN的主要代谢产物犬尿喹啉酸(kynurenic acid，KYNA)对维持中枢神经系统正常生理功能有重要作用。TRP 在血浆中以游离和结合形式存在，一般情况下，两种形式的 TRP 处于一种动态平衡状态。血浆游离 TRP 和支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)浓度参与调解脑内TRP 浓度，当血浆游离TRP浓度升高时，进入脑内的TRP则增多，脑内KYN代谢通路活化增强[16]。生理情况下，外周血中TRP 和KYN可通过神经源性氨基酸转运体进入脑组织，KYNA分子因极性强难以通过血脑屏障，但血清KYNA的浓度变化可通过TRP和KYN影响脑内KYNA的水平[17]。

本次研究发现汉族、哈族病例组色氨酸含量低于对照组(P<0.05)，而三民族病例组间色氨酸含量差异有统计学意义(P<0.05)。结合上述色氨酸与帕金森病相关研究报道，推测可能由于患者在以往日常生活中色氨酸摄入过少、过度消耗代谢酶类异常等导致血清色氨酸水平下降，进而影响正常KYN代谢途径，进入脑内的TRP、 KYN 过少使得脑内 KYNA 水平降低，病理性的易化EAA受体的活化，引起神经元钙超载和多种破坏性酶类的激活以及活性氧簇的大量产生、PD患者黑质纹状体系统多巴胺能神经元进行性坏死及相应脑区 DA 水平降低等，从而引发或进一步加重PD。在接下来的研究中可以通过检测患者血清 KYN、KYNA 含量，间接了解患者血清TRP代谢情况。

奶制品中的色氨酸是人体8种必需氨基酸之一，牛奶中的L-色氨酸是大脑合成5-羟色胺的主要原料，而五羟色胺能使大脑思维活动暂时受到抑制，它不仅有抑制大脑兴奋的作用，还有镇静作用，能够使人产生疲倦的感觉。在2010年4月11日的“帕金森病日”上，整个协会帕金森病患者的“少喝牛奶、多食肉食、海鲜，适量饮茶、咖啡，蛋白质摄入重新分配”的饮食原则，给本病患者及家属在饮食上提出了相应的饮食指导意见[18]。由于维吾尔族及哈族均为游牧民族，历代以来生活中喜饮牛、羊、马、骆驼奶等鲜乳制品，而奶茶等成为他们每顿餐桌上不可缺少的饮品，此外少数民族生活中还将鲜乳制品制作成酸奶、奶皮子、酸奶疙瘩、酥油、奶酪等乳制品，是每个维吾尔族及哈萨克族人平素生活中不可或缺的进食物质。从实验数据也可看出，维吾尔族及哈族帕金森患者血清中色氨酸量均较汉族偏高，且这种差异有意义，这也提示帕金森病患者在饮食上要注意适量控制色氨酸摄入量。