维吾尔族、汉族女性冠心病病人TGF-β1基因多态性分布情况研究

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冠状动脉因狭窄、阻塞或其功能异常，导致心肌细胞缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病被统称为冠心病(coronary heart disease，CHD)[1]。它是由多种危险因素和遗传基因相互作用而导致的慢性复杂性疾病。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)参与冠状动脉粥样硬化的形成和狭窄、心肌梗死后重塑、细胞凋亡等过程，它通过促进细胞外基质沉积、脂质条纹早期病变和动脉粥样硬化等诱发CHD的发生[2]。确定CHD的易感基因及其在维吾尔族、汉族间的差异，可从分子水平对CHD的发病机制有进一步的认识，从而更好地控制病因及改善预后。

新疆是中国心血管病的高发地区，CHD的发病规律因民族、性别及地域等因素的不同也不尽相同[3]。由于女性CHD在预后、寿命、生存质量等方面有别于男性，且其是威胁女性健康和生命的主要疾病，近年来更多的研究关注于对女性CHD的发病及预后情况。本研究中将TGF-β1基因作为主要研究指标，在基因水平上了解TGF-β1基因多态性在维吾尔族、汉族女性CHD分布情况，探究该人群CHD发病率的差异性是否与此相关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择在新疆维吾尔自治区中医医院就诊的明确诊断为CHD的维吾尔族及汉族女性病人作为研究对象，严格按照纳入及排除标准共收集180例女性冠心病病人，其中维吾尔族70例(38.9%)，年龄(59.70±8.21)岁；汉族冠心病110例(61.1%)，年龄(60.09±6.13)岁。同时选择年龄、性别和民族相匹配的健康女性100名(健康对照组)，其中维吾尔族40名(36.36%)，年龄(60.03±6.61)岁；汉族60名(63.64%)，年龄(58.40±6.41)岁。入选的研究对象均知情同意。制定纳入病例一般情况及中医证候类型调查表，并记录所有研究对象一般资料(年龄、性别、民族、诊断等)。研究对象一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法 对所有研究对象抽取血样，进行DNA提取，统一进行基因检测。受试者知情同意，空腹采集静脉血4 mL，k2-EDTA抗凝。3 000 r/min离心分离血浆和红细胞，有形细胞层于1周内行单个核细胞基因组DNA的提取，提取后的DNA置-20 ℃环境保存备用。基因多态性检测技术(SNP检测技术)：①DNA样本取1 μL，运用1% 琼脂糖电泳，对其进行质量检查和浓度估计，然后根据其估计的浓度，将样本稀释至5 ng/μL～10 ng/μL。②进行多重聚合酶链式反应(PCR)：对PCR引物(rs1800469、rs2241715、rs480345、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs1800471)进行扩增，PCR扩增后取3 μL PCR产物用ExoI和FastAP纯化，用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP，37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min，纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物(其PCR扩增引物序列详见表1)。③ SNaPshot多重单碱基延伸反应，对延伸引物进行延伸反应，并进行PCR循环程序(预变性：96 ℃ 1 min，变性：96 ℃ 10 s，退火：52 ℃ 5 s，延伸：60 ℃ 30 s，共30个循环)。④延伸产物纯化，取1 μL延伸产物，加9 μL上样HIDI，95 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪。⑤延伸产物上ABI3730XL测序仪，将各组分混匀，95 ℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪并对原始数据进行分析。SNP位点扩增结果见图1。

表1 PCR扩增引物设计

图1 SNP位点扩增结果

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行分析，计量资料符合正态分布以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或方差分析；不满足正态分布的资料用中位数(四分为数区间)表示，采用两独立样本的秩和检验；符合正态分布的计数资料采用χ2检验；不符合正态分布的用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 对180例维吾尔族、汉族女性冠心病及100名健康对照组TGF-β1基因的rs1800469、rs2241715、rs480345、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs18004718个位点基因型分布进行吻合度分析，频数分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明纳入病例具有群体代表性。

2.2 女性冠心病及健康女性在TGF-β1基因表达比较 对女性冠心病与健康女性TGF-β1的8个基因位点基因型分布进行比较，rs8105161、rs2241716两位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，rs1800469、rs2241715、rs4803455、rs8110090、rs1800470、rs1800471位点的基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)，结果提示rs8105161、rs2241716位点基因可能与女性CHD发病有关。详见表2。

表2 女性冠心病和健康女性的基因型分布 例(%)

2.3 维吾尔族、汉族女性冠心病在TGF-β1基因表达上的比较 TGF-β1基因检测的8个位点中，rs8110090、rs8105161、rs1800471三个位点的基因型分布频率在维吾尔族、汉族女性CHD间的差异有统计学意义(P<0.05)，其他5个位点的基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。因维吾尔族、汉族遗传基因存在种族差异，考虑该差异可能与维吾尔族、汉族对CHD的易感性不同有关。详见表3。

表3 维吾尔族、汉族女性冠心病组间的基因差异 例(%)

3 讨 论

冠心病是心血管疾病中最常见疾病，根据2016年美国最新发表的心血管及脑卒中相关数据[3]，CHD发病率及死亡率仍然呈现上升态势，心源性死亡是女性目前首要的死亡原因，其中CHD患病率为6.1%，与男性相比低2.2%，其中45岁～65岁女性的缺血性心脏病、微血管病变和非梗阻性CHD发病率较高，65岁以上高龄妇女，梗阻性心脏病患病率明显增加。由于特殊的地理环境、风俗习惯以及种族遗传因素，新疆是我国心血管病的高发地区[4]。前期相关研究提示，维吾尔族、汉族女性CHD的发病特点、危险因素、遗传基因等方面都具有一定的差异性。CHD是由多种危险因素和遗传基因相互作用而导致的慢性复杂性疾病。TGF-β1是由血小板、骨细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等多种细胞组成的一种细胞因子，具有调节细胞分化、参与炎症和免疫等多种生物学活性[5]。TGF-β1参与冠状动脉粥样硬化的形成和狭窄、心肌梗死后重塑、细胞凋亡等过程，它通过促进细胞外基质沉积、脂质条纹早期病变和动脉粥样硬化，诱导血管平滑肌细胞肥大、成纤维细胞增生和成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转化，在血管损伤部位促使血管重塑、管腔狭窄等，从而导致CHD的发生[2]。但也有研究发现，TGF-β1能缓解损伤反应，保护细胞、促进修复、抑制粥样斑块的形成[6]，认为TGF-β1可能是冠状动脉的保护因子。TGF-β1基因定位于染色体19q13，存在多个SNP位点[7]。不同人群的TGF-β1基因多态性呈现不同的TGF-β1生物学效应，从而可能会影响该人群不同个体对相关疾病的易感性。近年来，国内外多项研究对不同人群的TGF-β1基因多态性与冠心病的相关疾病进行了关联探讨。韦常丽等[8]研究TGF-β1基因第1外显子+869T/C及+915G/C多态性与原发性高血压的关联性，结果显示携带+869T/C基因C等位基因的原发性高血压病人血压水平明显高于不携带者，故认为其+869T/C基因与原发性高血压有关，而+915G/C基因多态性与该疾病无明显关联。董建华等[9]研究TGF-β1T869C基因多态性与慢性肾衰竭的相关性，结果显示该基因多态性与慢性肾衰竭的进展有显著相关性，其中C等位基因和CC基因型对慢性肾衰竭进展具有遗传易感性。邹邵敏等[10]对340例CHD和271例非CHD病例TGF-β1基因的rs1800469多态位点进行分型及分析， CHD组与对照组的基因分布比较差异无统计学意义(P>0.05)，但T等位基因明显增加个体患CHD的发病风险(OR=1.49)。

本研究就TGF-β1基因的rs1800469、rs2241715、rs4803455、rs8110090、rs8105161、rs2241716、rs1800470、rs1800471八个基因位点的基因多态性进行分析，女性CHD组与健康对照组比较，rs8105161、rs2241716两位点基因型的分布频率差异有统计学意义(P<0.05)，其他位点基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)，提示rs8105161、rs2241716位点基因可能与女性CHD的发病有关。维吾尔族、汉族女性冠心病rs8110090、rs8105161、rs1800471三个位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，预测TGF-β1该位点的基因多态性对维吾尔族、汉族女性CHD的遗传易感性存在差异，考虑该差异与维吾尔族、汉族间遗传基因对CHD的易感性不同有关，但不同易感性对CHD发病的影响尚需进一步研究。