内眦区域组织结构薄层切片三维可视化

闫 帅 黄明玉 祁存芳

(青海大学,1 研究生院, 2 医学院人体解剖学教研室, 西宁 810001)

泪小管裂伤是眼外科常见的损伤,需要进行急诊手术恢复其解剖和功能的完整性,但在术中泪小管断端的寻找、支撑物的选用以及伤口缝合等方面存在某些争议[1-2]。然而,由于泪小管细小且位于约1cm2的狭小区域内,同时此区域还有皮肤,胶原纤维和弹性纤维、泪总管、肌纤维、泪囊等结构,对泪道的研究主要集中于泪囊和鼻泪管,而对泪小管与周围结构关系的研究鲜有报道。随着计算机信息技术的迅猛发展,三维重建技术在现代临床医学中得到极大程度的推广[3],同时基于影像手段的三维模型手术模拟已被广泛应用[4]。但由于泪小管周围的内眦区域为软组织,常规的影像学方法对其成像效果并不理想,相对来说,组织连续切片后进行三维重建可最大程度保持和呈现泪小管及其周围结构的原始位置和空间配布关系。本研究采用该方法对泪小管和内眦区域结构进行三维重建。

1 材料和方法

1.1 材料

成年国人内眦标本3例,标本由青海大学医学院人体解剖学教研室提供,均为男性,将内眦区域沿额骨和上颌骨眶缘、泪囊窝及眶内侧骨面分离,并对取下的标本修剪成约2cm×2cm×1cm的小块,内侧包括泪囊,外侧缘在泪点外0.5cm处,然后将其固定于15%的福尔马林溶液中。

1.2 内眦区域连续切片

标本经过脱水、透明、浸蜡,包埋于自制的包埋盒中。将组织皮肤朝上摆放,行组织切片,切片厚15μm,保留相邻2层切片作为1组,每组间隔45μm。经铺片、烤片,然后进行染色,第1层切片用H-E染色；第2层用Masson染色。

1.3 图像获取

将染色、封片后的组织切片置于显微镜下,对其中的各种显微组织成分进行观察,并从标本边缘开始用40倍镜进行拍摄,然后平移标本进行下一视野的拍摄,同一水平拍摄完毕后向下平移,进行下一水平段的拍摄,在拍摄中要保证相邻图像存在相同的组织结构以便后期图像的拼接,每个切片获得15～20个不等的图像。在对泪小管组织进行观察时,将显微镜调整到100和400倍并进行局部观察和拍摄。所获得的同一标本的40倍镜图像在Adobe Photoshop CS6软件中进行图像拼接,统一大小并进行压缩。

1.4 图像配准

将得到的相同染色的切片图像进行配准,以最外侧的图像为参考图像,在PS软件中打开,然后将与其相邻的相同染色的内侧切片图像导入到PS软件中作为浮动图像,设置浮动图像的不透明度为60%,按Ctrl+T对浮动图像进行旋转以及平移,使得浮动图像解剖结构与参考图像最大程度的重合。然后删除参考图像的图层,将浮动图像的不透明度调回100%,另存为保存,即完成1个图像的配准。依此方法将切片由外侧向内侧进行配准。

1.5 三维重建和可视化

选用切片连续性强、成像效果较好的1组标本切片图像进行三维重建。在3D-Doctor软件中打开切片图像,运用Boundary Editor功能手动勾画轮廓,用不同颜色标示泪小管、眼轮匝肌睑板前部浅头和Horner肌等区,设置X、Y、Z参数,用3D-Rendering菜单下的Surface Rendering选项对这些分区进行表面三维重建和可视化,最后将构建好的三维模型导出并保存。

2 结果

2.1 内眦区域显微结构观察

从泪点开始泪小管和泪总管内衬未角化的复层鳞状上皮(图1A),与睑缘处结膜上皮类型相同,泪总管开口于泪囊处可见泪总管部分突入泪囊而形成的皱襞,由复层鳞状上皮构成,其下方出现较明显的复层柱状上皮,两者间界限明显。泪囊内衬复层柱状上皮(图1B)。

泪点四周的纤维斜行环绕泪点,与前、后方皮下和结膜下的纤维相连。泪小管、泪总管和泪囊上皮细胞的下方可见明显的基底层细胞,基底层外为弹性纤维和胶原纤维。泪小管和泪总管周围的纤维大致可分为3层,靠近基底层的纤维排列较致密,环绕泪小管管壁,与基底层细胞关系紧密；中间的纤维斜行环绕泪小管,排列较疏松；最外层的纤维垂直泪小管,穿行于周围肌纤维之间,将肌纤维分割成小的肌纤维束,呈网状和皮肤及睑结膜下方的纤维相连(图1C、D)。

2.2 泪小管及周围组织的三维结构

从重建的3部分(图2)可以看到,泪小管整体形态完整,眼轮匝肌睑板前部浅头和深头(Horner肌)围绕泪小管排列。浅头起始于泪囊前方的内眦韧带,平行走行于泪小管的前方；Horner肌起始于泪囊的后方,在泪总管后方与其平行,在泪总管与上、下泪小管交界处,部分Horner肌肌纤维紧贴泪小管壁深入到上、下泪小管之间,逐渐向外,Horner肌分为上、下2部分,伴行泪小管走行。在上、下泪小管水平部的鼻侧端,Horner肌位于其后内侧,眼轮匝肌睑板前部浅头位于其前外侧,然后Horner肌逐渐向前外侧斜行,最终深、浅两头肌纤维在上泪小管的上方和下泪小管的下方汇合成为眼轮匝肌睑板前部肌纤维,经泪小管壶腹前方行向外侧。在泪小管水平部外侧段,泪小管后方与睑结膜之间的肌纤维明显少于其前方与睑部皮肤之间的肌纤维,甚至在泪小管水平部外侧段后方无肌纤维,取而代之的是增厚的泪小管周围的纤维组织。

在泪囊和泪总管的前方可见明显的内眦韧带,为内眦韧带前部,其上、下有眼轮匝肌睑板前部浅头和眼轮匝肌眶隔前部浅头肌纤维附着。内眦韧带前部后方的纤维包绕泪总管和泪囊,与泪囊筋膜相连。在泪囊和泪总管上方的内眦韧带有眼轮匝肌眶隔前部深头肌纤维附着,为内眦韧带的上部。在泪囊后方的内眦韧带有部分Horner肌纤维附着,是内眦韧带的后部。内眦韧带的3个分部中前部最长且易于观察,上部和后部短,都与泪囊筋膜关系紧密。

图1 泪小管及周围结构。A： 泪点,Masson染色,×400；B： 泪总管和泪囊,H-E染色,×400；C： 泪小管垂直部,Masson染色,×100；D： 泪小管垂直部,Masson染色,×400。→： 角化复层鳞状上皮；： 未角化复层鳞状上皮；： 复层柱状上皮.

图2 泪小管及周围结构三维模型。A： 泪小管正面观；B： 泪小管和Horner肌正面观；C： 泪小管和Horner肌背面观；D泪小管和眼轮匝肌睑板前部浅头正面观。浅蓝色： 泪小管；黄色： Horner肌；橘色： 眼轮匝肌睑板前部浅头.

Fig 1 Lacrimal canaliculus and surrounding structures. A： Lacrimal punctum, Masson staining, ×400; B： Common canaliculu and lacrimal sac,H-E staining, ×400; C： Vertical part of lacrimal canaliculus, Masson staining, ×100; D： Vertical part of lacrimal canaliculus, Masson staining, ×400. →： Keratinized complex squamous epithelium;： Nonkeratinized stratified squamous epithelium;： Stratified columnar epithelium.

Fig 2 Three dimensional model of lacrimal canaliculi and its surrounding structure. A： The front view of lacrimal canaliculi; B： The front view of lacrimal canaliculi and Horner’s muscle; C： The back view of lacrimal canaliculi and Horner’s muscle; D： The front view of lacrimal canaliculi and shallow head of the anterior part of the eyelid of orbicularis oculi muscle. Light blue： Lacrimal canaliculi; Yellow： Horner’s muscle; Orange： Shallow head of the anterior part of the eyelid of orbicularis oculi muscle.

3 讨论

3.1 泪道上皮的形态特点

泪道源于鼻上颌沟的外胚叶下陷形成的实心上皮细胞柱,上端出芽形成泪小管；随后细胞分解,分别形成泪小管、泪囊,泪点在胚胎6～7月出现[5-8]。但组织学观察可见,泪小管上皮与结膜的上皮形态一致,在泪囊腔内可见泪总管突入其中形成皱襞,泪总管上皮与泪囊上皮之间泾渭分明。有文献报道,睑裂狭小综合症为常染色体显性遗传疾病,其典型异常表现为斜视、弱视、睑外翻、视神经异常、泪道狭窄等[9],而目前有关睑裂狭小结合症的泪道发育异常的类型包括泪点移位、泪小管狭窄、副泪点、泪点缺如等[10]。根据泪小管上皮与结膜的上皮形态一致和眼睑发育异常可导致泪小管狭窄的特点,是否可推断在泪小管形成过程中,泪囊部外胚层细胞团形成的上、下两个索状分支构成了泪小管的基部,在泪小管管腔形成的过程中,来自眼睑皱褶的内表皮上皮伸展进入泪小管而构成了泪小管的上皮细胞,并伸入泪囊而形成泪总管皱襞。

3.2 泪小管及毗邻结构的关系

文献报道,泪小管上皮下富有弹力纤维,四周环型围绕眼轮匝肌纤维[8]。笔者在对组织切片和三维模型的分析后发现泪小管周围包绕着三层纤维,使泪小管管壁与肌纤维、皮肤和结膜连成一个整体。

在泪小管颞侧4/5部分周围有Horner肌,也被称为眼轮匝肌泪部,在鼻侧1/5部分,Horner肌走行于泪总管后方[11]。目前对于Horner肌的归属有两种观点,一种是将Horner肌称为眼轮匝肌泪部,与睑部和眶部并列；另一种观点认为眼轮匝肌分为眶部、眶隔前部和睑板前部[12],睑板前部有深、浅两个头,深头为Horner肌。笔者观察靠近鼻侧Horner肌可见,其与前方的眼轮匝肌睑板前部浅头之间存在较明显的界限,而逐渐向外侧,可见两部分肌纤维之间的界限越来越模糊,直到Horner肌和眼轮匝肌睑板前部浅头在壶腹外侧汇合。

Horner肌与眼轮匝肌睑板前部浅头的位置关系和走形特点决定了当这两部分肌纤维收缩,挤压泪小管,并通过纤维组织牵拉泪囊,改变管腔大小和形状,从而影响泪液的引流[13]。

3.3 切片法三维重建内眦区域

目前,通过影像学方法进行三维重建已十分成熟,相比之下,组织切片进行三维重建发展则较为迟缓。由于切片过程易造成切片变形、移位、甚至碎裂,以及对于肌纤维纤细、结构复杂且没有包膜肌纤维重建而言,组织学切片技术不是最好选择[14]。泪小管上皮下方有明显的基底细胞层,相对于周围的肌纤维,可以分辨出其大体轮廓,因此本研究重建后的泪小管形态良好,与实体解剖的泪小管标本一致,但是重建后的肌纤维无法清晰显示其纤维走行,效果并不理想。而且在实际操作中,切片厚度、染色批次、拍照自然条件、曝光等必然会影响切片质量,如果这些因素处理不当,对后期图像的配准、轮廓划分以及模型建立都会造成很大的困难,因此找到一种稳定、可靠适用于精细组织的切片三维重建的方法是十分必要的。