气味训练对血管性痴呆大鼠内源性神经干细胞增殖分化及DACH1蛋白表达的影响❋

邢雪松 吕威力

(沈阳医学院, 1 解剖学教研室, 2 病理学教研室, 沈阳 110034)

缺血性脑损伤是严重危害人类健康的疾病,存在高致残率[1-3]。较多研究已经证实脑缺血能促进成年动物脑内神经干细胞(neural stem cells, NSCs) 的增殖、迁移和分化,分化的新生神经元能部分替代受损的神经元,从而在一定程度上改善神经功能缺损[4-5]。DACH信号通路参与调控细胞内多种信号途径,在促进细胞增殖分化等过程中起着十分关键的作用[6]。本研究利用两血管阻断加硝普钠降压法建立大鼠血管性痴呆(vascular dementia, VD)模型,研究检测Nestin和细胞命运决定因子(cellfate determination factor dachshund 1, DACH1)在血管性痴呆海马组织中的表达及气味训练和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干预作用,探讨血管性痴呆内源性神经干细胞与之相关因子的改变及气味训练的干预,对其增殖分化机制进行初步的阐明。

1 材料和方法

1.1 血管性痴呆模型的制备

健康雄性Wistar大鼠78只,2月龄,体质量220～240g,由沈阳医学院实验动物中心提供。随机分为4组： 假手术组(Sham组,n=6),模型组(Model组,3、7、14、21d,n=24),训练组(Training组,3、7、14、21d,n=24),bFGF组(bFGF组,3、7、14、21d,n=24)。采用两血管阻断加硝普钠降压法建立血管性痴呆动物模型。术前12h禁食、4h禁水。1%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧位固定在手术台上,常规消毒,行颈正中切口,分离双侧颈总动脉(common carotid arteries, CCA),玻璃针小心分离双侧迷走神经,避免牵拉,模型组在夹闭双侧CCA之前,腹腔注射硝普钠(2.5mg/kg),随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA 10min 后,再通10min,再夹闭10min,再通后缝合伤口,放回笼中保温饲养,庆大霉素局部预防感染。实验过程中用多导生物记录仪记录大鼠血压,记录显示硝普钠腹腔注射前大鼠平均动脉压维持在103mmHg左右,注射后平均动脉血压迅速下降至至51mmHg左右,持续约2min后缓慢上升至69mmHg,1h内持续维持于该水平。在造模过程中保持动物直肠温度在37℃ 左右,以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。假手术组不阻断CCA及注射硝普钠,其他与模型组相同。训练组于造模1d后开始给予气味训练,bFGF组腹腔注射bFGF,此后分别于3、7、14、21d后处死取材,常规H-E染色。

1.2 气味穿梭训练

实验以气味乙酸异戊酯为条件刺激,电击为非条件刺激。先将大鼠放入穿梭箱内暗适应5min,然后持续乙酸异戊酯刺激,如大鼠不逃到另一端,则给于电击,电流强度10～20mA,使动物逃至箱底不通电一侧,此时电击停止,否则持续受电击5s。消除气味后开始下一轮训练。于造模1d后行气味穿梭训练,每次实验进行20次气味、电刺激。

1.3 给药方法

bFGF为北京双鹭药业股份有限公司研制,用注射用水稀释, bFGF组腹腔注射10μg/kg,其余组腹腔注射等量生理盐水,缺血后即刻给药。

1.4 行为学评分

各组大鼠麻醉清醒后进行模型筛选,造模成功大鼠分别进行神经行为学评分,评分参照Zea Longa 5分制标准： 0分： 没有神经功能缺损；1分： 前爪不能完全伸展；2分： 行走时,大鼠向两侧晃动；3分： 行走时,大鼠身体向两侧倾倒；4分： 不能自发行走,有意识丧失。评分为0分和4分者均被剔除,随机补充,保证每亚组6只不变。

1.5 脑梗死体积测定

各组大鼠于再灌注后3d迅速断头取脑,置-70℃冰箱速冻10min,取其前脑从额极到枕极切成2mm厚的冠状面脑片,将切片立即置于2%TTC磷酸缓冲液中避光、37℃恒温孵育30min,取出置于4%多聚甲醛中固定2h。正常脑组织被染成鲜红色,而梗死区呈苍白色。将固定的脑片按切片顺序排列。数码相机拍照后,应用Metamorph-Evolution MP 5.0显微图像分析系统测量前脑总面积和脑梗死面积,根据公式V=t(A1+A2+A3+—+An)-t(A1+An)算出前脑总体积和梗死体积。其中t为切片厚度,A为梗死面积。

1.6 Nestin免疫荧光染色

各组大鼠常规灌注取脑,连续冰冻冠状切片,片厚约30μm,隔5取1,进行免疫荧光检测。切片首先0.01mol/L PBST,2N HCL/PBS,37℃孵育30min。0.1mol/L硼酸缓冲液浸泡,0.01mol/L PBST。加入血清A,37℃孵育15min,倾去,勿洗。滴加稀释的羊抗nestin一抗(浓度为1∶2000),4℃过夜。0.01mol/L PBST洗涤。滴加TRITC-兔抗山羊二抗(1∶100),避光条件下,37℃孵育30min。避光条件下,0.01mol/L PBST洗涤。避光条件下,贴片避光、阴干、稀释甘油封片后荧光显微镜观察并拍片。每只大鼠切片中选取呈典型反应的3张切片,每张切片于海马齿状回区选取3个视野进行计数,采用Image-Pro Plus 5.0图像处理软件对结果进行图像分析处理,计数每个视野中nestin阳性细胞数目。

1.7 DACH1 的免疫组织化学检测

取各组缺血海马(AP前囟-3.14～前囟-4.5mm),片厚约3mm,浸入4%多聚甲醛固定液中,24h后应用免疫组织化学染色检测缺血海马DACH1的表达情况。切片滴加正常山羊血清(37℃,30min),分别滴加一抗兔抗鼠DACH1 4℃过夜,滴加二抗(37℃,60min),滴加ABC复合液(37℃,60min),以上各步间均PBS冲洗(5min×3次),DAB显色(15min),蒸馏水冲洗,常规脱水、透明,中性树胶封片。空白对照片一抗用0.01mol/L PBS代替。光镜下观察切片, 用Metamorph/Evolution MP 5.0显微图像分析系统每张切片测5个相同单位面积的平均灰度值。用统计软件SPSS 10.0进行t检验和方差分析。

2 结果

2.1 脑梗死体积比较

假手术组未见梗死灶,和模型组相比,训练组和bFGF组梗死体积明显减小(表1)。

2.2 H-E染色评估组织学改变

假手术组神经元数量多,排列整齐,形态完整；模型组细胞肿胀,分布不均,细胞周围间隙增宽,有的细胞体积缩小,核固缩深染,其中3d组织变化最为明显；训练组和bFGF组海马存活神经元数比模型组增多,神经元胞体肿胀明显减轻,细胞形态明显改善。

表1 各组大鼠脑梗死体积比较(mm3)

*P<0.05vsmodel group

2.3 Nestin免疫荧光染色检测

阴性对照海马未见nestin阳性细胞。假手术组海马仅见少量散在的nestin阳性细胞,3、7、14、21d间相互比较差异无统计学意义。模型组3d时,缺血海马nestin阳性细胞开始增多,大小不一,呈簇状分布;7d达峰值;21d海马nestin免疫阳性细胞数逐渐减少; 训练组和bFGF组与模型组比较,3、7、14d和21d缺血海马nestin阳性细胞均明显增多(P<0.05) (表2，图1)。假手术组大鼠海马齿状回颗粒层可以观察到少量nestin阳性细胞。

表2 大鼠脑缺血后海马组织nestin阳性细胞数

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

2.4 气味训练对DACH1影响的免疫组织化学检测

脑组织切片中显示细胞质、细胞核内有明显黄色、棕褐色颗粒为DACH1蛋白阳性。在假手术组海马DACH1有轻微表达。DACH1反应产物脑缺血再灌注第7天较假手术组有所增多,随缺血再灌注时间的进一步延长逐渐增加,第14天后持续高水平表达,直到21d(P<0.05)。训练组和bFGF组,在海马神经元质、细胞核内可见棕黄色颗粒,DACH1阳性产物表达较3、7、14d和21d 模型组表达增加(P<0.05) (表3,图1)。

表3 大鼠脑缺血后海马神经元DACH1表达的平均灰度值

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

3 讨论

血管性痴呆是由一系列脑血管因素导致脑组织损害所引起的痴呆综合症,以记忆力减退、表情淡漠、呆滞和人格改变为主要临床表现。已证实在成年海马齿状回颗粒下区存在内源性神经干细胞。在一定条件下NSCs能够增殖,并向特定方向分化,参与神经功能修复的过程[7-8]。

VD患者大脑的病理性变化,如神经元丢失,先可以在嗅皮层中观察到,并逐渐延伸至海马和其周围结构,已知海马和内嗅皮质是VD患者大脑结构中最明显的易受损区。海马是机体感觉和运动的整合区,与认知功能和中枢神经系统突触的可塑性有关,是学习记忆的神经细胞学基础。同时海马也是嗅觉系统的投射区,可见嗅觉投射区域与学习记忆神经中枢存在部分重叠,故VD和嗅觉之间有在密切联系[9-10]。

DACH1蛋白的DS结构域,是DACH1发挥生物学功能的主要部位。DS结构域具有DNA结合能力,可以通过与c-Jun、Smads、Six和ER等转录因子相互作用,在基因转录调控方面发挥重要功能[11-12]。TGF-β超家族主要由一些在细胞生长、分化、凋亡、迁移或血管生成等方面发挥调节作用的多功能细胞因子组成。Dach1与CBP(cyclic AMP-responsive element-binding protein)的结合可能会竞争性抑制其他需要结合CBP发挥作用的分子的功能,例如β-catenin、R-smad(smad2/smad3)等,有研究证明β-catenin可以在CBP的介导下与smad3相结合,作用于TGF-β的效应基因的作用,抑制TGF-β对Wnt信号通路活性的增强作用[13-15]。因此推测Dach1可以抑制TGF-β和Wnt两条信号通路对NSCs的促增殖的调控作用。

本研究通过脑梗死体积比较显示, 假手术组未见梗死灶，和模型组相比,训练组和bFGF组梗死体积明显减小。说明训练组和bFGF组对血管性痴呆大鼠脑损伤具有修复作用。本研究通过Nestin免疫荧光染色检测显示,模型组和bFGF组大鼠脑缺血后7d时神经干细胞增殖达高峰,21d时干细胞数量下降,分化为神经元和神经胶质细胞。本实验观察气味训练和bFGF组对缺血再灌注后大鼠海马DACH1表达的影响,结果显示训练组和bFGF组DACH1阳性产物表达较模型组海马明显增加,21d达高峰,从一个侧面探讨气味训练和bFGF对神经干细胞增殖分化的作用机制。

图1 血管性痴呆大鼠海马nestin、DACH1阳性细胞及H-E染色,×200Fig 1 Nestin and DACH1 positive cells of vascular dementia rats, ×200A: Nestin positive cells of model 7d group; B: Nestin positive cells of training 7d group; C: Nestin positive cells of model 21d group; D: Nestin positive cells of training 21d group. E: DACH1 positive cells of model 7d group; F: DACH1 positive cells of training 7d group; G: DACH1 positive cells of model 21d group; H: DACH1 positive cells of training 21d group; I: H-E staining of model 3d group; J: H-E staining of training 3d group