膨化壳聚糖铜对仔猪肠道微生物区系的影响研究

王卫秦，袁奎超

(1.河南新乡卫辉市畜牧局，河南 卫辉 453100；2.河南省新蔡县畜牧局，河南 新蔡 463500)

抗生素被用做畜禽生长促进剂曾经发挥了非常重要的作用，很大程度上促进了畜牧业的发展[1]。但是，由于抗生素的过度使用，动物体和环境中细菌、霉菌等病原微生物耐药性逐渐增强，其对畜禽的生长促进作用逐步下降，同时畜禽体内过多抗生素残留物也对人类健康造成了严重威胁[2]。近年来，随着生活水平的提高，人们对食品安全问题的关注度越来越高。目前，包括我国在内的许多国家正在考虑禁止动物饲料中添加抗生素。寻求绿色、高效、天然的抗生素替代品，已成为畜牧业研究的重点与热点。

作为抗生素的替代品之一，壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰基的产物。甲壳素为可再生的天然资源，自然界中存在的唯一带阳离子的天然活性多糖就是壳聚糖,它可广泛应用于食品、医药、畜牧及环保等领域。壳聚糖的功能与其分子质量大小关系密切,可降解成低聚糖和壳寡糖,发挥出免疫调节、抑菌、抗肿瘤等功能。

铜不仅参与造血和铁的代谢，而且构成许多含铜酶及含铜生物活性蛋白，与维持核酸结构的稳定性有关，是动物体内必需的微量元素[3]。高铜作为促生长剂可以促进畜禽的采食量、改善肠道健康、减少体内有害微生物[4]。但过度使用无机铜(主要为硫酸铜)不仅造成资源的浪费和环境污染问题的产生，还在一定程度上破坏其它营养物质的吸收利用。研究表明，有机铜的稳定性更好，不仅可以降低与矿物质元素间的拮抗作用，而且减少了对其它营养物质结构的破坏[5]；有机铜的溶解度高，容易被小肠黏膜吸收，使铜资源更有效地被利用；同时有机铜的单位促生长效果更为明显，可有效替代无机铜的作用。

早期断奶仔猪，消化酶系的发育尚不健全，内源消化酶活性低，消化系统形态结构变化明显，阻碍了断奶仔猪正常的生长发育。仔猪肠道微生态区系极不稳定，且因为断奶引起的应激反应，严重影响了肠道内正常菌群的建立。有研究表明，壳聚糖对空肠与盲肠两个部位的调节作用更为明显[6]。然而，目前有关壳聚糖在生产中的研究主要集中在简单粉碎产物上，有关二次加工物研究较少。本研究以膨化处理后的壳聚糖微粒与铜的络合物作为试验材料，旨在探讨壳聚糖对仔猪菌群影响的机理，筛选膨化壳聚糖铜作为仔猪饲料添加剂的最适添加量，为开发绿色、环保型仔猪饲料添加剂提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

膨化壳聚糖铜(河南科技学院动物营养组提供)、M肉汤培养基、RS培养基、伊红美兰(EMB)、志贺氏-沙门氏琼脂培养基。

1.2 试验动物

28日龄杜×长×大外三元杂交断奶仔猪96头(购于河南谊发牧业)。

1.3 试验设计及日粮组成

试验选取96头28日龄断奶仔猪(杜×长×大)，随机分为4个日粮处理组(设3个试验组和1个对照组)，每组3个重复，每个重复8头，公母各半。试验组在基础饲粮里分别添加0.01%、0.02%、0.04%含量的膨化壳聚糖铜，预试期7 d，正试期为40 d。本试验在河南省谊发牧业有限公司进行，试验舍为仔猪保育舍，试验期间仔猪自由采食、饮水，猪场按常规免疫程序免疫，舍内平均温度20～25 ℃。

表1 试验分组

供试验用基础日粮按照NRC(2012)猪营养标准配制[7]，其原料组成与营养水平见表2。其中预混料含有的微量元素与维生素的含量分别为：Cu 10 mg/kg、Fe 80 mg/kg、Mn 30 mg/kg、Zn 80 mg/kg、I 0.5 mg/kg、Se 0.3 mg/kg、VA 5 000 IU/kg、VD3200 IU/kg、VE 20 IU/kg、VK31.30 mg/kg、VB14 mg/kg、VB24 mg/kg、 VB62 mg/kg、VB1220 mg/kg、泛酸18 mg/kg、烟酸 26 mg/kg、胆碱 56 mg/kg。

1.4 测定指标

肠道挥发性脂肪酸VFA测定(毛细管气相色谱法)、乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、拟杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、摩氏变形菌(平板培养)细菌计数[8]。

表2 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

1.5 粪便菌群的测定

饲养试验结束当天，选取对照组和各试验组猪进行屠宰，每组屠宰4头猪，在每头猪相同部位取回肠、结肠和盲肠内容物约2g，按光冈氏肠内菌群法进行操作[9]。在超净工作台中取结肠、盲肠、直肠内容物各0.5g，放入无菌试管中，加入无菌PBS稀释液4.5mL，震荡5min，此液为10-1稀释液，按此方法依次进行10-3～10-6倍稀释。取不同肠段、不同浓度的稀释液0.1mL涂于鉴定培养基上。拟杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养48h，平板计数法计数菌落。大肠杆菌、摩氏变形菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌分别在伊红美兰、志贺氏-沙门氏琼脂培养基及肉汤培养基中37℃有氧培养24h，然后进行菌落计数[10]。根据菌群细胞形态、甲基红(M.R)试验、产吲哚试验、革兰氏染色法等方法来鉴定这几种细菌[11]。

1.6 数据处理与统计

所有数据均以平均数±标准差表示，采用SAS 8.0统计软件进行单因素方差分析[12]。

2 结果与分析

2.1 膨化壳聚糖铜对断奶仔猪盲肠微生物的影响

见表3。

表3 膨化壳聚糖铜对仔猪盲肠微生物(×105 CFU/g)的影响

注：字母相同者差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同

由表3可知：盲肠段0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，乳酸杆菌分别提高了48.89%(P<0.05)、34.42%(P<0.05)，其0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，双歧杆菌分别提高了34.83%(P<0.05)、24.48%(P<0.05)、15.92%(P>0.05)。0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，芽孢杆菌分别提高了39.44%(P<0.05)、17.77%(P<0.05)，0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。拟杆菌各组试验结果差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，大肠杆菌分别降低了47.39%(P<0.05)、36.36%(P<0.05)、18.49%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，沙门氏菌分别降低了41.7%(P<0.05)、28.51%(P<0.05)和15.11%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，产气荚膜梭菌分别降低了38.26%(P<0.05)、24.4%(P<0.05)、12.44%(P<0.05)。摩氏变形菌各组试验结果差异不显著(P>0.05)。

2.2 膨化壳聚糖铜对断奶仔猪结肠微生物的影响

见表4。

表4 膨化壳聚糖铜对仔猪结肠微生物(×105 CFU/g)的影响

由表4可知：结肠段0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，乳酸杆菌分别提高了55.71%(P<0.05)、36.60%(P<0.05)，其0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，双歧杆菌分别提高了50.74%(P<0.05)、38.12%(P<0.05)、42.93%(P>0.05)。0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，芽孢杆菌分别提高了42.93(P<0.05)、24.15%(P<0.05)，其0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。拟杆菌各组试验结果差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，大肠杆菌分别降低了38.66%(P<0.05)、27.88%(P<0.05)、14.82%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，沙门氏菌分别降低了40.75%(P<0.05)、28.31%(P<0.05)和 15.67%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，产气荚膜梭菌分别降低了 27.22%(P<0.05)、20.28%(P<0.05)和 8.86%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，摩氏变形菌分别降低了35.37%(P<0.05)、24.23%(P<0.05)、12.24%(P<0.05)。

2.3 膨化壳聚糖铜对断奶仔猪直肠微生物的影响

见表5。

表5 膨化壳聚糖铜对仔猪直肠微生物(×105 CFU/g)的影响

由表5可知：直肠段0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，乳酸杆菌分别提高了23.81%(P<0.05)、14.64%(P<0.05)，其0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，双歧杆菌分别提高了34.02%(P<0.05)、27.26%(P<0.05)、17.41%(P>0.05)。0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，芽孢杆菌分别提高了27.10%(P<0.05)、16.06%(P<0.05)，其0.04%试验组和0.02%试验组相比差异不显著(P>0.05)。拟杆菌各组试验结果差异不显著(P>0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，大肠杆菌分别降低了32.30%(P<0.05)、23.33%(P<0.05)、11.10%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，沙门氏菌分别降低了35.60%(P<0.05)、26.34%(P<0.05)和13.18%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，产气荚膜梭菌分别降低了 29.62%(P<0.05)、19.94%(P<0.05)和10.41%(P<0.05)。0.04%试验组、0.02%试验组和0.01%试验组与对照组相比，摩氏变形菌分别降低了27.71%(P<0.05)、21.33%(P<0.05)、10.51%(P<0.05)。

3 讨论与结论

本试验结果表明，日粮中添加0.02%膨化壳聚糖铜可显著促进大肠内有益菌乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌的增殖，显著降低有害菌大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌和摩氏变形菌的数量。

研究表明，膨化壳聚糖铜具有较强的抗菌、杀菌及增强机体免疫功能的作用[13-14]。冯小强等[15]发现壳聚糖铜(Ⅱ)配合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌作用。本试验研究发现，0.02%试验组能显著降低大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌和摩氏变形菌等有害菌菌群数量(P<0.05)，同时提高乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌等有益菌菌群(P<0.05)的数量。