急性ST段抬高型心肌梗死患者血浆miR-1、miR-146b的表达及临床意义

陈其敬，罗江宾，张云波，陈林

(三亚市人民医院，海南三亚 572000)

急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)是临床常见的心肌梗死类型[1，2]，心电图和心肌标志物如心肌肌钙蛋白I(cTn I)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)[3]对其诊断具有重要意义。cTnI在胸痛发作4～12 h即可检测到，但对STEMI早期诊断的敏感度不足；同时cTnI在其他心肌损伤疾病中亦有升高，其诊断STEMI的特异性也较差[4,5]。CK-MB主要存在于心肌中，STEMI发病24 h才能达到高峰，也不能满足STEMI早期诊断的需求[3]。近年来，微小核糖核酸(miRNAs)参与心肌损伤、心肌肥厚、心律失常等心血管疾病发展过程的报道逐渐增多[6,7]。本文就STEMI患者血浆miR-1、miR-146b的表达及临床意义探讨如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年3月～2017年2月本院收治的STEMI患者79例(观察组)，其诊断均符合2012年全球统一心肌梗死的定义[8]。纳入标准：①年龄超过18岁；②临床资料完整，且临床依从性高；③患者及其家属同意本研究，并签署知情同意书。排除标准：①合并先天性心脏病、心房纤颤、外周血管疾病；②呼吸功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病；③入组前1个月内进行肾脏替代治疗。另外选择同期在本院进行治疗的非STEMI胸痛患者59例(对照组)，两组性别、年龄、高血压史、糖尿病史、吸烟史构成及BMI、收缩压、舒张压、TC水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究所有过程均符合医院医学伦理委员会的相关规定，并获医学伦理委员会批准实施。

1.2 血浆样本采集 患者发病后不同时间点：入院时(T0)以及入院12 h(T1)、24 h(T2)、48 h(T3)、7 d(T4)采集全血样本5 mL，置于涂有肝素钠的采血管中，以3 000 r/min离心10 min，分离上清液获得血浆，置于-80 ℃冰箱中备用待测。

1.3 血浆CK-MB和cTnI水平检测 采用酶联免疫吸附测定法检测血浆CK-MB和cTnI水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 血浆miR-1、miR-146b检测 采用实时定量PCR 法。使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取全血总RNA，具体操作按照说明书进行。应用M-MLV逆转录酶将2 μg总RNA转录合成为cDNA，内参设置为U6。逆转录印务序列如下：miR-1：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG

CACTGGATACGACTACATAC-3′；miR-146b：5′-GGGGTGAGAACTGAATTCCAGTGCGTGTCGTGGAG

TCG3′；U6：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用SYBR Green PCR Master Mix(美国ABI公司)试剂盒，反应体系变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、20 s，延伸70 ℃、10 s，一共进行40个循环。Ct值为样本表达标准量，血浆miR-1、miR-146b相对表达水平以2-ΔΔCt计算。

1.5 冠脉造影评分 采用美国心脏病学会/美国心脏学会评分法评估冠状动脉病变的严重程度[9]。常规经桡动脉途径或股动脉入路对7个体位进行造影，选择8支主要血管进行评分。狭窄程度<10%为0分；10%≤狭窄程度<49%为1分；50%≤狭窄程度<74%为2分；75%≤狭窄程度<89%为3分；90%≤狭窄程度<100%为4分。权重系数均为1，每支血管评分=每支血管的权重系数×狭窄程度权重系数，总分为8支血管评分总和。

2 结果

2.1 两组血浆CK-MB及cTnI水平比较 观察组血浆CK-MB、cTnI表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 两组血浆CK-MB、cTnI水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 观察组不同发病时刻血浆miR-1、miR-146b水平变化 与对照组相比，观察组T0、T1、T2及T3时血浆miR-1、miR-146b表达水平均升高(P均<0.05)。观察组血浆miR-1、miR-146b表达水平不同发病时刻先升高后降低，在T1时血浆miR-1、miR-146b表达水平最高，与其他时间点比较差异有统计学意义(P均<0.05)；观察组T4时血浆miR-1、miR-146b表达水平与对照组之间的差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 观察组不同发病时刻血浆miR-1、miR-146b水平变化±s)

注：与对照组比较，*P<0.05;与观察组T0、T2、T3、T4比较，△P<0.05。

2.3 STEMI患者血浆miR-1、miR-146b表达与CK-MB、cTnI水平及冠脉造影评分的关系 STEMI患者血浆miR-1表达水平与CK-MB、cTnI水平及冠脉造影评分呈正相关(r分别为0.738、0.729、0.693，P均<0.05)，血浆miR-146b表达水平与CK-MB、cTnI水平及冠脉造影评分亦呈正相关(r分别为0.715、0.706、0.732，P均<0.05)。

3 讨论

miRNAs由19～25个核苷酸组成，为一段发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成，广泛存在于真核细胞中，独立于其他基因，不能翻译成蛋白质，可与目的信使RNA的3′非翻译区特异性结合，通过切割和降解信使RNA从而抑制目的蛋白的表达[10,11]。已经发现超过1 000种人类miRNAs与相应蛋白质结合后形成稳定的复合体，抑制RNA酶的降解，从而在内环境中稳定存在成为临床检测指标[12]。目前对于miRNAs的应用主要集中两方面：一方面基于miRNAs特性寻求个性化治疗途径，另一方面筛选特异性生物标志物为临床治疗提供靶点。临床多采用实时定量PCR技术定量分析血浆miRNAs表达水平[13]。

miR-1基因定位于人类20号染色体，在肌肉及心肌组织中高度表达[14]，miR-1参与心肌细胞的分化、凋亡及心脏发育过程，并且影响冠状动脉疾病、心力衰竭等心血管疾病的发生及发展。miR-1是心肌细胞中表达水平最高的miRNAs，参与心肌前体细胞分化、心肌肥厚及心肌梗死的发生过程，检测外周血miR-1水平对于急性心肌梗死的诊断及其他相关性心血管疾病的防治具有重要意义。健康机体血浆中miR-1的含量极低。急性心肌梗死患者的心肌细胞破裂，使得miR-1进入血液循环，血浆中miR-1的表达水平升高，在一定程度上可以反映心肌损伤程度，并且可为预后评估提供证据[15]。miR-146家族成员包括miR-146a和miR-146b。miR-146b位于人体第10号染色体，在多种细菌成分刺激人类单核细胞的抗菌谱研究中均可发现[16]。国内对于miR-146b研究多集中于肿瘤及炎症方面，对于急性心肌梗死的研究鲜有报道。动物实验结果表明，miR-146b在心肌缺血、再灌注损伤及病毒性心肌炎中表达水平升高[17]。本研究STEMI患者血浆miR-1、miR-146b、CK-MB及cTnI表达水平均高于对照组，同时与对照组相比，STEMI患者T0、T1、T2及T3时血浆miR-1、miR-146b表达水平均明显升高；STEMI患者血浆miR-1、miR-146b表达水平先升高后降低，在T1时表达水平最高，具有时间依赖性。相关性分析结果发现，STEMI患者血浆miR-1和miR-146b表达水平与CK-MB、cTnI水平及冠脉造影评分呈正相关，说明血浆miR-1和miR-146b升高可提示STEMI的发生。有研究显示，冠状动脉闭塞致使心肌缺血而发生心肌梗死，miR-1通过抑制B细胞淋巴瘤/白血病2抗凋亡因子和胰岛素样生长因子1的表达加速心肌细胞凋亡，增加梗死面积[14]。动物实验结果发现，miRNA释放到体循环的过程具有相对选择性。其中miR-1具有心肌特异性，心肌梗死时间长短对于miR-1释放进体内的过程有重要影响[18]。miR-1加速心脏祖细胞分化为心肌细胞，同时将成纤维细胞编程为心肌细胞样细胞，通过促进心肌细胞增生从而治疗急性心肌梗死[19]。急性心肌梗死的病理基础为冠状动脉粥样硬化、细胞内皮损伤及炎症反应。miR-146b是炎症反应调节因子，通过介导炎症反应损伤内皮组织，进而参与心血管疾病的发生及发展。

综上所述，血浆miR-1和miR-146b水平变化与STEMI患者血浆标志物CK-MB、cTnI水平关系密切，是诊断STEMI的潜在生物标志物，可能为临床STEMI治疗提供新的靶点。