黄连素对人主动脉血管平滑肌细胞钙化的作用及其机制

张鑫鹏，曾存良，孙晓磊，何虎强，胥雄飞，曾宏，施森，刘勇

(1成都市第三人民医院，成都610031；2 达州市中心医院；3西南医科大学附属医院)

血管钙化是糖尿病、慢性肾病、高血压患者常见病理表现，以动脉内膜钙化及动脉中膜钙化为主[1]。近年研究表明，动脉中膜钙化是多种因素及信号通路参与调控人主动脉血管平滑肌细胞(HASMCs)成骨分化的过程，与糖尿病心血管并发症及病死率升高密切相关[2]。本课题前期研究显示，糖基化终末产物(AGEs)可诱导HASMCs向成骨细胞表型转化，与诱发炎症、氧化应激、凋亡因子生成以及激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关[3]。黄连素是一种具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等多种功效的植物生物碱，可通过下调ERK/p38 MAPK抑制HASMCs增殖[4]，减缓成软骨分化过程，缩小动脉粥样硬化斑块[5]。但是，其是否能够抑制AGEs诱导HASMCs钙化鲜有报道。2015年11月～2017年3月我们在AGEs诱导体外HASMCs钙化模型基础上，探究黄连素通过细胞外信号调节激酶(ERK)/p38 MAPK通路防止血管钙化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 原代HASMCs及培养基(美国Sciencell公司)，黄连素(美国Sigma公司)，细胞内钙含量试剂盒、细胞冯库萨和茜素红染色试剂盒(上海杰美基因公司)，骨保护素(OPG)、骨桥蛋白(OPN)及骨形成蛋白-2(BMP-2)(英国Abcam公司)，ERK、p38 MAPK蛋白(美国CST公司)。

1.2 HASMCs培养、分组及处理 复苏HASMCs，用HASMCs培养基在37 ℃、5%CO2湿热培养箱中培养，用0.125%胰蛋白酶消化传代，传代后取4～10代培养细胞作为研究对象。 取上述平滑肌细胞生长至融合状态后，置于6孔板中进行如下分组及处理。①对照组：加入生理盐水；②DMSO组：加入0.1% DMSO；③AGEs组：加入100 mg/L AGEs[6]；④AGEs+黄连素组：加入100 mg/L AGEs及不同浓度黄连素(10、25、50 μmol/L)。每组设3个副孔，细胞每隔3 d换液1次，连续培养7 d。

1.3 HASMCs钙化染色鉴定 ①冯库萨染色：细胞种于12孔板予以不同刺激14 d后，加入500 μL冯库萨固着液，浸润细胞爬片，室温孵育10 min，小心移除固着液，PBS清洗3次，加入500 μL冯库萨染色液，室温至于太阳光直射下60 min，移去染色液，PBS清洗3次，取出爬片，空气中晾干，显微镜下钙盐沉积处为黑色。②茜素红染色：细胞种于12孔板予以不同刺激14 d后，加入500 μL茜素红固着液，浸润细胞爬片，室温孵育10 min，小心移除固着液，PBS清洗3次，加入500 μL茜素红染色液30 min，移去染色液，PBS清洗3次，取出爬片，空气中晾干，显微镜下橘红色为钙化结节。

1.4 HASMCs钙含量测定 细胞刮脱棒轻柔刮脱6孔板细胞，加入3 mL PBS 混匀细胞，移入15 mL预冷锥形离心管，放入4 ℃离心机1 000 r/min离心5 min；小心移去上清液，加入200 μL裂解液，转入1.5 mL预冷离心管，涡旋震荡15 s，静置冰槽30 min，4 ℃ 12 500 r/min 离心10 min，小心移去上清液至新预冷1.5 mL离心管，移取10 μL用细胞钙离子定量试剂盒测定，酶标仪波长设置为570 nm。

1.5 HASMCs内各类蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取6孔板内贴壁细胞总蛋白，取各组样本蛋白20 μg行SDS-PAGE 电泳分离蛋白。用400 mA 1 h 电转法将蛋白转移至PVDF膜，用5% 脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入一抗孵过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗孵育1 h，充分洗涤后加入增强发光液，即刻与底片曝光，并用Quantity One软件系统进行光密度分析。选择AGEs作用15 min作为MAPK信号通路各蛋白表达的最适测量时间[7]。

2 结果

2．1 各组HASMCs染色变化 ①冯库萨染色显示：与对照组相比，AGEs组HASMCs透明度降低，呈多层叠加生长，部分细胞破碎，且黑色沉淀区域面积明显增多；相比于AGEs组，AGEs+黄连素组，黑色沉淀区域面积明显减少，且随黄连素浓度增加而减少。②茜素红染色显示：与对照组相比，AGEs组橘红色钙化结节明显增加；与AGEs组相比，AGEs+黄连素组橘红色钙化结节明显减少。

2.2 各组HASMCs内钙含量 对照组、 DMSO组、 AGEs组、 AGEs+10 μmol/L黄连素组、AGEs+25 μmol/L黄连素组、AGEs+50 μmol/L黄连素组钙含量分别为(0.646±0.199)、(0.805±0.151)、(4.203±0.234)、(3.394±0.229)、(2.895±0.392)、(2.135±0.399)mmol/g。与对照组相比，AGEs组胞内钙含量增加(P<0.05)，说明AGEs可以诱导HASMCs钙化。与AGEs组相比，AGEs+不同浓度黄连素组胞内钙含量降低(P均<0.05)，且AGEs+不同浓度黄连素组之间胞内钙含量随浓度增加而下降(P均<0.05)。

2.3 各组HASMCs内OPG、BMP2、OPN蛋白表达 与对照组相比，AGEs组OPG、BMP2、OPN表达量增高(P均<0.05)；与AGEs组相比，AGEs+黄连素处理组OPG、BMP2、OPN表达量降低(P均<0.05)，且AGEs+不同浓度黄连素组HASMCs内OPG、BMP2、OPN蛋白表达随浓度增加而下降(P均<0.05)。见表1。

表1 各组HASMCs内OPG、BMP2、OPN蛋白表达(n=3,±s)

注：与对照组相比，*P<0.05；与AGEs组相比，**P<0.05。

2.3 各组HASMCs内ERK、p38 蛋白表达 与对照组相比，AGEs组HASMCs内ERK、p38 蛋白表达增高(P均<0.05)；与AGEs组相比，加入不同浓度黄连素组ERK、p38蛋白表达量减少(P均<0.05)，且AGEs+不同浓度黄连素组HASMCs内ERK、p38 蛋白表达随浓度增加而下降(P均<0.05)。见表2。

表2 各组HASMCs内ERK、p38 蛋白表达(n=3,±s)

注：与对照组相比，*P<0.05；与AGEs组相比，**P<0.05。

3 讨论

近年研究表明，血管钙化与糖尿病肾病、心肌梗死、脑卒中等多种疾病密切相关，细胞外基质理化性质改变及血管平滑肌细胞表型转化对血管钙化至关重要[8]，其中血管平滑肌细胞表型改变、胞内钙含量增加与磷酸酶活性增强等在血管钙化中起重要作用[9]。血管平滑肌细胞是参与血管钙化调控主要因子之一，在糖尿病患者体内过高的血糖浓度及胰岛素抵抗增强将促进AGEs大量生成，AGEs刺激细胞外基质构成改变，激发AGEs-RAGE信号轴，进而激活一系列信号通路，诱导血管平滑肌细胞成骨分化，促进糖尿病血管钙化[10]。

血管钙化是与骨发育相似的主动、高度可调控的复杂病理生理过程，且在上述各种因素刺激下血管中膜HASMCs表型由收缩型转变为合成分泌型，并最终发展为成骨样细胞表型[11]，而表型转化后的平滑肌细胞具有成骨样细胞特点：即质膜上都表达碱性磷酸酶，分泌Ⅰ型胶原、OPN、骨钙蛋白和骨连蛋白，而这些蛋白均受MAPK信号的调控[12]。研究发现，AGEs/RAGE轴活化多种细胞因子使MAPK激活，致MAPK下游因子入核进一步调控内质网应激、氧化应激、脂质代谢、钙磷代谢等生理过程，诱导组织分化及凋亡[13]。MAPK是多种胞外刺激的关键因素，在调节细胞多种生理过程起重要作用。近年来研究发现，ERK、p38 MAPK途径通过调节增殖、分化功能，实现参与胚胎期的骨生长发育、出生后的骨量平衡、骨折愈合等众多骨生长改建过程。大量研究表明，MAPK信号通路是骨形成过程中最关键的信号通路。Chen等[14]发现敲除ERK1/2、p38 MAPK的小鼠骨形成和骨再吸收明显受到抑制，并且阻止骨髓间充质祖细胞向成骨细胞分化。Chen等[15]发现MAPK信号的激活促进与骨形成有关的蛋白表达。

已经证实，黄连素在糖尿病患者降血糖方面以及抗炎、抗病毒、降脂等方面具有重要作用。近期研究表明，低浓度黄连素抑制p38/JNK MAPK磷酸化，缓解小鼠左心室重构并减少心肌梗死病死率。Cui等[16]研究发现黄连素通过抑制ERK/p38/JNK MAPK抑制胰腺炎症因子Th17及Th1分泌，实现小鼠I型糖尿病治疗。在糖尿病慢性肾脏疾病肾组织炎症信号通路中，黄连素可抑制p38 MAPK干预炎症反应；抑制高糖诱导的肾系膜细胞增殖及细胞外基质沉积，进而防止肾血管纤维化[17]，此外，黄连素可通过下调ERK/p38/JNK MAPK信号通路，抑制肺癌、肝癌等肿瘤细胞增殖。本研究证实黄连素可以抑制AGEs诱导的HASMCs钙化，并且通过部分抑制AGEs对ERK/p38 MAPK磷酸化的激活作用，进而减少HASMCs成骨分化表型OPG、BMP2、OPN表达来实现抑制其钙化作用。

本研究同时从冯库萨及茜素红两种染色法证实AGEs促HASMCs钙化灶形成，黄连素可以抑制AGEs诱导HASMCs钙化作用。而大量研究表明HASMCs钙化与HASMCs增殖、迁移、凋亡呈正相关[18]，间接印证黄连素具有抑制血管平滑肌细胞增殖迁移能力。同时本研究证实AGEs上调ERK/p38 MAPK磷酸化表达量，这与近年研究ERK/p38 MAPK磷酸化表达量同HASMCs钙化呈正相关相符合[19]；而黄连素可下调AGEs这一作用，其抑制AGEs诱导HASMCs钙化与ERK/p38 MAPK密切相关。

综上所述，黄连素可通过调控AGEs-ERK/p38 MAPK轴，抑制ERK/p38 MAPK通路表达激活，实现对AGEs诱导HASMCs向成骨细胞分化作用削减，进而缓解糖尿病患者动脉中膜钙化。其机制可能与减少相关因子胞质/胞核转位，使OPG、BMP2、OPN等成骨分化因子表达量减少密切相关。黄连素调控MAPK通路在抑制糖尿病血管钙化过程中的分子机制可为寻找临床药物治疗新靶点提供理论依据。