绿壳蛋鸡青年鸡疑似心包积液—肝炎综合征的实验室诊断

2018-10-10徐明举李珮瑶张瑞华

畜牧与饲料科学 2018年9期

徐明举，李珮瑶，徐彤，利凯，田勇，张瑞华

（河北北方学院预防兽医学重点实验室，河北张家口 075000）

心包积液—肝炎综合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）又称安卡拉病毒病［1］，该病于1987年最早发现于巴基斯坦安卡拉地区［2］，主要表现为心包积液、肝炎等病理特征。1989年在墨西哥、印度、伊拉克、智利、秘鲁、俄罗斯和孟加拉国等国家都相继发现该病［2-3］。HHS主要是引起 20～30日龄肉鸡发病，发病后 4～8 d为死亡高峰，病程 8～15 d，死亡率达 20%～80%，一般在30%左右。任传德等报道我国吉林省于2010年11月某肉鸡群发生HHS［4］。近年来，该病在我国发病的区域不断扩大。除了肉鸡感染外，不断发现蛋用雏鸡和产蛋鸡群的发病报告，因此给我国养鸡业造成了较大的危害和经济损失［5-6］。以上表明我国的鸡HHS亦需要引起足够的重视，这对保护鸡群健康和避免养禽业遭受经济损失有重大研究意义。

2017年，河北省涿鹿县某个山间林下饲养的60～80日龄绿壳蛋鸡青年鸡发生以突然死亡和剖检表现为心包腔有大量黄色清亮液体、肝脏明显肿大为特点的急性传染性疾病，死亡率为36%。经临床症状以及剖检变化初步怀疑为HHS。鉴于HHS在我国部分省区呈现发病趋势不断扩大的实际，以及目前国内有关HHS的防治缺乏有效的疫苗及相关药物的现实，开展HHS相关的研究迫在眉睫。鉴于以上原因，开展对疑似HHS病例详细的实验室诊断，以分离、证实该病病原，为进一步开展疫苗以及相关防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验用 11日龄 SPF鸡胚、10周龄雏鸡购于北京实验动物中心。营养琼脂、麦康凯琼脂均为上海博微生物科技有限公司产品，生产批号分别为160419和160528。鸡Ⅰ群腺病毒血清4型标准抗原和标准阴、阳性血清均为广州测迪生物科技有限公司产品，生产批号分别为20160428和201602。其他常规试剂等由预防兽医学重点实验室提供。

1.2 细菌分离

在无菌条件下取病鸡的肝脏组织及心包积液，在麦康凯琼脂和营养琼脂培养基上划线进行细菌分离。经37℃培养24 h后，观察是否有细菌生长。

1.3 病毒分离

无菌条件下剖检具有典型HHS特征发病死亡的鸡，采集心包积液、肝脏、脾脏、肺、肾脏等样品装入1.5 mL试管中，保存于－80℃低温冰箱、待用。将上述组织取出、按常规方法处理后，加入青霉素、链霉素抑菌处理，10 000 r/min离心10 min取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，将上述滤液经尿囊腔途径接种10只11日龄的鸡胚，每胚0.2 mL。接种后每天照胚2次，检出死亡鸡胚，一直孵化至144 h，弃掉24 h内死亡鸡胚。收获上述鸡胚尿囊液传代培养，并观察鸡胚病变。

1.4 病毒鉴定

1.4.1 待检病毒电镜形态观察：收集心包积液、肝脏等样品接种的11日龄SPF鸡胚48 h尿囊液，经传代3次后，取1 mL尿囊液10 000 r/min离心10 min取上清液；13 000 r/min离心1 h，弃去上清液；剩余100 μL混悬液，吹打均匀后滴上2%磷钨酸染液，片刻后将多余的染液吸干，透射电子显微镜下观察病毒形态结构。

1.4.2 待检病毒红细胞凝集试验：腺病毒具有凝集不同动物红细胞的特性，为此制备0.5%的鸡、鸭及大鼠红细胞悬液，按常规方法进行微量红细胞凝集试验。

1.4.3 病毒血清型鉴定：取新鲜病死鸡的肝脏，剪碎、研磨，按1∶3比例加入生理盐水做成混悬液，冻融3次后离心取上清液（为待检抗原），应用阳性血清进行琼脂扩散沉淀实验测定待检抗原。

1.5 感染试验

收集第5代尿囊液，采用腹腔注射方式接种10只10周龄SPF鸡，每只0.2 mL，并设定对照组，隔离饲养，逐日观察至第14天。记录攻毒后鸡的临床表现以及统计死亡率。收集感染雏鸡组织，分离病毒。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

在无菌条件下取病鸡的肝脏组织以及心包积液，在营养琼脂和麦康凯琼脂平板上进行细菌分离。培养24 h后分离到3株大肠杆菌。但利用该3株分离菌接种SPF鸡未出现典型临床症状及发病死亡。

2.2 病毒分离

待检病毒通过尿囊腔接种于11日龄的SPF鸡胚，在6 h的培养观察中，3枚鸡胚于96 h死亡，另有2枚于120 h死亡，至144 h将未死鸡胚取出置4℃冰箱过夜。收集鸡胚尿囊液，-80℃低温冰箱保存、待用。观察发现其感染的鸡胚胚体呈现蜷曲、出血，并且肝脏肿大。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 电镜观察：在电子显微镜下观察到病毒尿囊液中的大量病毒粒子，其直径为60～80 nm，呈圆形（见图1）。

图1 病毒形态

2.3.2 红细胞凝集试验：血凝试验结果发现该病毒对鸡和鸭红细胞不具备血凝能力，但可以凝集大鼠红细胞，这与Ⅰ群腺病毒的红细胞凝集特性相一致。

2.3.3 病毒血清型鉴定：标准抗原孔和阳性血清孔之间出现了1条清晰的乳白色的沉淀线，与阴性血清孔之间没有沉淀线的出现；待检孔和阳性血清孔之间出现了1条清晰的沉淀线，并且和标准抗原孔与对照阳性血清孔之间的沉淀线互相吻合，所以证实分离得到的病毒为禽Ⅰ群腺病毒血清4型。

表1 SPF雏鸡感染死亡情况只

2.4 感染试验

接种病毒的雏鸡在第4天开始出现死亡，之后陆续有死亡，一直观察到攻毒后第8天，死亡总数达到6只，死亡率已到达60%，从第8天之后没有再出现死亡情况；而对照组一直到观察结束，其临床表现均正常，并未出现死亡现象（见表1）。剖检病死鸡可发现其心肌柔软，心包有大量淡黄色透明积液；肝脏肿胀、充血，呈土黄色，质地脆软，被膜下有出血点（见图2）。死亡鸡剖检变化与自然发病鸡一致，均有典型的心包积液—肝炎综合征的病变特征。

图2 感染试验结果

3 讨论

禽腺病毒是引起家禽发病的常见的病原，禽腺病毒根据其抗原结构分为3个亚群，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群。Ⅰ群主要是传统的腺病毒，在鸡群中现已分离确定 12 个血清型（FAdv-1～FAdv-12）；Ⅱ群腺病毒主要引起火鸡出血性肠炎，Ⅲ群则引起蛋鸡的产蛋下降综合征［7-8］。研究表明，禽腺病毒不同的血清型，甚至是相同血清型的不同毒株，其引起发病和致死的能力也有所不同，但目前已证实Ⅰ群腺病毒中的血清4型是引起鸡心包积液—肝炎综合征（HHS）的特异性病原［9-10］。

该研究在河北省涿鹿县某个山间林下饲养的60～80日龄绿壳蛋鸡青年鸡中采集死亡鸡病变组织，通过细菌及病毒的分离、鉴定和动物感染试验可确定其病原为禽腺病毒血清4型，而心包积液—肝炎综合征就是由腺病毒属（Ⅰ亚群禽腺病毒）腺病毒血清4型（FAdv-4）引起的一种新型家禽疫病。其在各个品种各个年龄的鸡都有发生，而在我国也有 10～20周龄蛋鸡感染腺病毒的病例［11-12］。据任传德等［4］报道，HHS可导致肉鸡的发病死亡率在20%～80%。梁广成等［13］报道分离到1株高致病FAdv-4，经肌肉接种1 000 EID50病毒量导致3周龄SPF鸡的致死率为90%。该试验物感染试验结果与临床剖检病变一致，在动物感染试验中，攻毒鸡死亡率为60%。

尽管目前鸡心包积液—肝炎综合征对我国养鸡产业造成严重的经济损失，但由于我国目前缺乏有效的商品化疫苗［13-15］，目前尚无有效的防控措施，因此，目前我国防治心包积液—肝炎综合征多采用综合性防控措施。建议采取加强饲养管理，预防接种自家组织灭活苗，紧急注射卵黄抗体，配合使用抗病毒、保肝护肾、利水消肿、增强免疫力、防治继发感染的药物。加强HHS疫苗的研究，采取疫苗免疫成为预防和控制该病的当务之急。韦悠等以Ⅰ群腺病毒中的FAdv-4和FAdv-8型全毒株制备油乳剂灭活疫苗免疫后攻毒保护率达到100%［16］，提示其疫苗免疫完全可行并具有良好的保护效果。