纳米载银室温固化型PMMA材料对小鼠肝组织和肝细胞DNA损伤的影响

史金先，张赐童，刘 璐， 黄天意，闫通通，孙世群，王晓容

(1. 吉林大学口腔医院修复科，吉林 长春 130021;2．吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室， 吉林 长春 130021)

银(Ag)具有抗菌谱广和抗菌能力强等优点，近年来以纳米银、银盐等不同形式添加到医疗产品中以增强其抗菌性能[1]。银及其化合物作为抗菌剂时主要是银离子(Ag+)发挥抗菌作用[2],然而Ag+与水接触时释放速度加快，影响材料的抗菌长效性，同时过量释放的银还会造成肝肾功能损害以及哺乳动物细胞毒性的产生[3]，因此需要一种能够使其缓慢释放的方法保证抗菌的长效性及生物安全性[4]。纳米载银无机抗菌剂是将具有抗菌活性的Ag+通过物理吸附或离子交换等方式附载在无机载体上，有效控制Ag+释放速度以达到长效抑菌的效果，还可降低银的使用量，同时利用纳米技术研制的纳米载银无机抗菌剂具有纳米材料优异的理化特性，可明显增强抗菌性能[5]。

口腔是一个特殊的微生态环境，存在大量的条件致病菌和不断变化的物理化学因素。材料在复杂的口腔环境中特别是唾液的长期浸泡下，溶解物通过口腔与机体内各脏器相互作用。室温固化型聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)是口腔科常用材料，本课题组前期实验证实：添加质量分数为2%的纳米载银无机抗菌剂可明显增强室温固化型PMMA材料的抗菌活性且不影响其机械性能[6]。但由于口腔环境特殊的理化性质，材料长期在患者口内发挥作用，不仅要求其具有良好的理化性能，生物相容性检测也尤为重要。纳米复合材料的毒性受多种因素影响，应用于医疗产品中的纳米材料及其所携带的金属离子可从不同途径进入体内，直接作用于遗传物质或通过促进活性氧生成等机制造成潜在的毒性反应[7]。现阶段有关纳米复合材料的毒理学检测结果不尽相同，主要是针对细菌和细胞系等进行的体外研究，体内研究报道仍然有限。本研究通过小鼠体内实验检测纳米载银室温固化型PMMA材料对小鼠肝组织及肝细胞DNA损伤的影响，旨在为纳米载银室温固化型PMMA材料体内毒理学研究提供理论依据，进一步完善该材料的生物相容性检测。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 40只雄性昆明种小鼠购于吉林大学实验动物中心，6～8周龄，体质量(23±2)g，动物合格证号：SYXK(京)2014-0004。义齿基托聚合物Ⅱ型粉剂(仿生型)和液体(日进齿科材料有限公司)，RHA-1型纳米载银无机抗菌剂(上海润河纳米材料科技有限公司)，正常熔点琼脂糖(invitrogen)、低熔点琼脂糖和甲基磺酸乙酯(EMS)(合肥博美生物科技有限公司)，Gel-Red染液(上海碧云天生物技术有限公司)，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)检测试剂盒和门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。40 μm细胞过滤器(Biologix)和DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，IX71型荧光倒置显微镜(日本Olympus 公司)，酶标仪(美国 Biotek公司)。

1.2 抗菌试件及浸提液的制备 采用球磨法制备抗菌母料，再将抗菌母料充分研磨制备质量分数为2%的纳米载银抗菌剂的室温固化型PMMA材料。按照厂家说明书和国家标准(GB/T16886.12-2005)利用模具制作标准尺寸为25 mm×5 mm×2 mm的试件，采用水砂纸由粗到细逐次打磨抛光，分别将含和不含抗菌剂的PMMA试件按照1.0 g/5 mL比例浸泡于生理盐水中，置于37℃恒温摇床中浸提72 h制备浸提原液。

1.3 实验动物分组和处理 40只雄性昆明种小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组、纳米载银室温固化型PMMA组(PMMA-NM组)和普通室温固化型PMMA组(PMMA组)。其中浸提72 h浸提液(200 g·L-1)为高浓度组，将72 h浸提液稀释1/2(100 g·L-1)为中浓度组，将72 h浸提液稀释1/4(50 g·L-1)为低浓度组。同理将PMMA组也分为高浓度组、中浓度组和低浓度组，每组5只。各组小鼠实验前适应环境7 d。在实验开始、24 h和45 h采用相应试剂对各实验组及阴性对照组小鼠经口灌胃，阳性对照组小鼠仅在24和45 h经口灌胃给予EMS。阴性对照剂生理盐水，阳性对照剂EMS和各实验组的浸提液的灌胃浓度为20 mL·kg-1，阳性对照组EMS的给药浓度为100 mg·kg-1，EMS在每次使用前1 h内溶解于生理盐水中。最后一次灌胃后3 h取材。

1.4 血清生化指标检测 各组小鼠在最后一次灌胃3 h后，摘眼球取血置于含分离胶的促凝管中，待血液自然凝固后，3 000 r·min-1离心15 min分离血清，按照试剂盒说明书操作，510 nm条件下酶标仪检测各组样品的吸光度(A)值，绝对A值=测定孔A值-对照孔A值，查标准曲线，求得相应的ALT/AST活力单位。剩余血清-20℃保存备用。

1.5 肝脏系数计算 在小鼠处死前称量体质量，处死后立即对其进行解剖，去除肝脏周围的结缔组织，完整取出肝脏，称肝脏质量，计算肝脏系数，肝脏系数=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%。

1.6 彗星实验(comet assay，CA)检测尾部DNA百分比(% tail DNA)、尾长(tail length,TL)和Olive尾矩(olive tail moment,OTM)水平 取新鲜肝脏左侧外叶约5 mm3大小，在预冷的切碎缓冲液(20 mmol·L-1EDTA-2Na溶解于无钙镁和酚红的Hank’s溶液中，调节pH值至7.5，使用前加10%DMSO)中短暂漂洗至无血液可见，将肝组织转移至含有约3 mL切碎缓冲液的培养皿中，用眼科剪刀精细剪碎以充分释放肝细胞，经40 μm细胞过滤器将细胞悬浮液过滤至50 mL离心管中,调整细胞密度为1×106mL-1。

将 100 μL 1%正常熔点琼脂糖(溶于D-PBS)均匀铺在预热(37℃)的载玻片上，迅速盖上盖玻片，置于4℃冰箱10 min使琼脂糖凝固。取10 μL单细胞悬液与100 μL 0.5%低熔点琼脂糖(溶于D-PBS)混匀，将110 μL混合物均匀铺在第一层琼脂糖上，加盖玻片，将载玻片置于4℃冰箱10 min，待其完全凝固后移除盖玻片，将载玻片立即置于预冷的裂解溶液(100 mmoL·L-1EDTA-2Na，2.5 moL·L-1NaCl，10 mmoL·L-1Tris，调节pH值至10, 使用前加1%Triton-X100和10%DMSO)中4℃避光裂解1 h以上。细胞裂解后，用中和缓冲液(0.4 moL·L-1Tris-HCl，pH7.5)洗涤载玻片，将载玻片平行放置在加有预冷电泳液(pH值>13)的电泳槽内，4℃避光使DNA双链解旋30 min。然后以电场强度0.7 V·cm-1，电流300 mA电泳30 min，用Tris-HCl缓冲液中和3次，每次10 min。实验过程需在低温避光条件下进行，以防止额外的DNA损伤产生。最后用无水乙醇脱水固定15 min，室温干燥后用Gel-Red染液进行荧光染色。每张载玻片随机选择50个彗星图像，每只动物制备2张胶板，采用彗星图像分析软件CASP(Comet Assay Software Project)分析% tail DNA、TL和OTM，以上述3项指标表示各组试剂对于小鼠肝细胞DNA损伤的影响。

1.7 统计学分析 采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。正态分布检验采用One-sample Kolmogorov-Smirnov法，方差齐性检验采用Levene检验。不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，即M(Q)。不同材料组与阴性对照组间肝脏系数、%tail DNA、TL和OTM符合正态分布的计量资料，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Dunnett’s test法；不符合正态分布的计量资料(ALT和AST)比较采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-wallisH)。纳米载银室温固化型PMMA材料中不同浓度组间比较，符合方差齐性检验的计量资料(TL和OTM)比较采用单因素方差分析；方差不齐的计量资料(% tail DNA)比较采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-wallisH)。阴性对照组与阳性对照组组间比较及相同浓度不同材料组2组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清生化指标 纳米载银室温固化型PMMA组(低、中和高浓度浸提液)和室温固化型PMMA组(低、中和高浓度浸提液)小鼠血清ALT和AST水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，同一浓度纳米载银室温固化PMMA组 ALT和AST水平与室温固化PMMA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组小鼠血清中ALT(A)和AST(B)水平

2.2 各组小鼠肝脏系数 实验过程中无实验动物死亡，小鼠各项生命活动正常，未观察到明显的中毒症状和体征。各实验组小鼠肝脏系数与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与阳性对照组比较明显降低(P<0.05)，阳性对照组小鼠肝脏系数明显高于各实验组(P<0.05)；纳米载银室温固化PMMA组浸提液低、中和高各浓度间，同一浓度下的抗菌性室温固化PMMA组肝脏脏器系数与普通室温固化PMMA组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肝质量、体质量和肝脏系数

*P<0.05 compared with positive control group.

2.3 彗星实验检测肝细胞% tail DNA、TL和OTM 纳米载银室温固化型PMMA组(低、中和高浓度浸提液)和室温固化型PMMA组(低、中和高浓度浸提液)的% tail DNA、TL和OTM与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，同一浓度下的纳米载银室温固化型PMMA的% tail DNA、TL和OTM与普通室温固化PMMA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组的% tail DNA、TL和OTM明显高于阴性对照组(P<0.05)。见表2。

表2 彗星实验检测各组小鼠肝细胞% tail DNA、TL和OTM

*P<0.05 compared with negative control group.

3 讨 论

纳米载银无机抗菌剂具有耐高温、抗菌谱广且抗菌效能持久等优点，近年来不断被应用于口腔新型材料的研发中[8]。然而各类纳米材料的不断研发应用常伴有一些潜在的不良反应[9]：一方面金属纳米材料会增强离子在器官中的聚集；另一方面，纳米粒子一旦聚集在器官中一般需要很长时间才能清除，并且可能会产生持续的毒性[10]。纳米载银无机抗菌剂作为一种新型纳米抗菌材料对人体可能存在潜在的危害性。

研究[11]表明：Ag+和纳米银聚集的主要靶器官是肝脏，其可通过产生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起氧化应激造成肝损伤，影响肝脏的正常生理功能。肝脏系数以及血清生化指标能准确反映化学物质对肝脏的影响，血清中ALT和AST是反应肝功能损害最灵敏且使用最为广泛的2种转氨酶。正常情况下，ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝细胞发生损伤时，这2种酶由受损的肝细胞释放到血液中，导致血清中酶水平升高[12]。Qin等[13]将纳米银以及AgNO3对大鼠口服染毒28 d，结果显示：肝脏组织病理学检测未发现明显变化，而血清生化指标AST水平升高，提示血清生化水平是反应其肝脏毒性的敏感指标。本实验中小鼠的肝脏系数和血液生化检测结果显示：添加了纳米载银抗菌剂的室温固化型PMMA材料的肝脏系数及ALT和AST水平未发生明显变化，表明该复合材料未对肝组织及其功能造成损伤。

彗星实验又称单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤和修复的遗传毒性检测方法[14],其具有需要组织细胞少，检测快速和灵敏度高等优点。彗星实验作为检测纳米材料遗传毒性最常用的实验方法[15]，现已通过经济合作与发展组织(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)权威认证并列入遗传毒性检测的序列实验中[16]。与传统的遗传毒性检测方法体内微核实验相比，具有受检组织来源广泛，对潜在的遗传毒性评估能力更强、灵敏度更高的优点[17]。彗星实验可以检测DNA修复以及各种类型的DNA损伤，包括DNA单、双链断裂，碱性不稳定位点(ALS)，DNA与DNA或DNA与蛋白质交联以及与单链断裂相关的不完全修复位点等多种DNA损伤类型。任何可制备单细胞悬液的组织均可作为受检对象，其对于靶器官潜在的遗传毒性检测也优于其他经典的遗传毒理学实验[18]。纳米载银无机抗菌剂的无机载体包括沸石、磷酸盐和二氧化钛等，其生物安全性与载体的种类、浓度和Ag+的释放量有关。本实验使用的纳米载银无机抗菌剂的抗菌成分为载银磷酸锆，其具有抗菌能力强、抗菌谱广和耐高温等优点。Chen等[19]将纳米载银磷酸锆、二氧化钛、载银二氧化钛和四针状氧化锌晶须4种无机抗菌剂加入到含有晶须和纳米氧化锆的PMMA复合材料中，其中纳米载银磷酸锆无机抗菌剂不仅增强了该复合材料的表面硬度，对变形链球菌和白色念珠菌表现出优异的抗菌性能，同时MTT法检测结果显示：其对于成纤维细胞不具有细胞毒性。现阶段对纳米载银磷酸锆的生物相容性研究局限于体外细胞毒性研究，对于动物体内的遗传毒性研究较少。因此本课题组将进一步利用体内彗星实验从遗传毒性方面检测纳米载银室温固化PMMA的生物相容性。

Juling等[20]通过大鼠短期体内研究证实纳米银及Ag+分布和聚集的主要脏器是肝脏，同时肝脏也是彗星实验标准化实验中最常用、遗传毒理学资料最全面的体内脏器[12]。因此本实验选择小鼠的肝脏作为制备单细胞悬液的组织脏器，增加了实验结果的可靠性和相关遗传毒理学资料的可比性。本研究中体内彗星实验检测结果显示：各实验组% tail DNA、TL和OTM水平与阴性对照组比较差异无统计学意义，均明显低于阳性对照组，提示该复合材料未对肝细胞造成DNA损伤，对小鼠肝细胞不具有遗传毒性。同时相同浓度的纳米载银室温固化PMMA组的DNA损伤水平与普通室温固化PMMA组比较差异无统计学意义，说明抗菌性纳米载银室温固化PMMA材料同普通室温固化PMMA材料类似，均具有较好的生物相容性。

综上所述，纳米载银室温固化型PMMA材料未对小鼠肝组织及肝细胞DNA产生不良影响，具有良好的生物相容性。本研究结果为该纳米复合材料的临床推广应用提供实验依据。