凤丹根腐病拮抗放线菌的分离筛选及鉴定

王 雪， 王 冉， 王 晔， 丁东玲， 位诗棋， 郑 艳

(安徽师范大学 生命科学学院 中药资源研究所，安徽 芜湖 241000；安徽省中药日化产品工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000)

产于安徽省铜陵地区(包括南陵)的凤丹皮为著名的道地药材，是常用传统皮类大宗中药牡丹皮中的上品，药用品质最佳[1-3]。素有“植物癌症”之称的根腐病对以根入药的多年生中药材是毁灭性的土传病害[4]，随着凤丹种植年限的增加，该病的发生日趋严重，腐皮镰刀菌是引发凤丹根腐病发生的主要病原菌，且根腐病治理中化学防治占较大比重，这严重影响了丹皮的质量与产量[5-7]。放线菌是一类重要的微生物资源，能产生多种次生代谢产物，对许多细菌和真菌都具有较强的抑制作用，在生物防治中具有广阔的应用前景[8]。目前，笔者未见道地药材基原凤丹根腐病拮抗放线菌的研究报道。本研究针对道地产区采收期1～5年生凤丹进行根腐病拮抗放线菌的分离纯化及筛选，有利于拮抗菌在凤丹根际定殖，为凤丹根腐病的生物防治、保障道地产区丹皮优质高产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试样品

供试土壤：利用五点取样法采集牡丹皮道地产区安徽南陵丫山的采收期1～5年生凤丹(经通讯作者鉴定为PaeoniasuffruticosaAndr.，凭证标本存安徽师范大学生命科学学院/中药资源研究所)根际土壤样品。去除凤丹植株表层土后，挖掘带根整体植株，震荡根部以去掉大块的土壤和有机质后用毛刷收集仍粘附在根表面的土壤作为根际土壤样品。每个样品设3个重复。采回的根际土壤样品放入无菌培养皿自然阴干，过2mm筛后备用。

供试菌株：凤丹根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠球菌(Canidiaalbicans)由安徽师范大学中药资源研究所微生物资源库提供。

供试培养基：包括高氏一号培养基等在内的多种放线菌鉴别用培养基[9]。

1.2 方 法

1.2.1 根际放线菌的分离、纯化 参考本课题组前期研究[10]，采用稀释涂布平板法分离样品中的放线菌。将涂布后的平板编号，正置1h后于28℃培养箱中倒置培养14d。从培养后第5天起，根据菌落颜色、形态、气生菌丝等特点挑选形态各异的放线菌单菌落，并进行纯化，同时于斜面培养基上4℃保存备用。

1.2.2 拮抗放线菌的筛选 初筛及复筛实验均采用平板对峙法。将0.1mL腐皮镰刀菌的培养液均匀涂布于PDA培养基上，表面晾干后备用。将培养5d的放线菌用无菌打孔器(直径5mm)沿菌落同心环上打孔，挑取菌饼放入晾干后的PDA培养基平板上，每皿均匀放置3块菌饼，28℃培养。3d后观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。每个处理重复3次，以不接供试放线菌菌株的平板作为对照(CK)。

1.2.3 拮抗放线菌发酵液对腐皮镰刀菌菌丝生长的影响 将培养5d的放线菌发酵液4000r·min-1离心，用0.22μm微孔滤器过滤后取离心后的发酵液5mL与冷却至45℃的100mLPDA迅速混匀制成带菌培养基。在凝固后的平板上放入直径6mm的茄病镰刀菌菌饼，以无菌水处理作为对照，重复3组，置于28℃培养箱中培养7d。利用“十”字交叉法测量菌落直径，计算公式：抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

1.2.4 对其它病原菌的抑制作用鉴定 采用平板对峙法探究抑菌活性优良的放线菌菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠球菌的抑菌活性。

1.2.5 拮抗菌株的鉴定 放线菌菌株的鉴定包括形态特征[11]、培养特征[9]、生理生化及耐受性测定[12]，此外参照薛应钰等[13]研究方法对菌株进行分子生物学鉴定，将PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序后得到的16SrDNA序列通过DNA star、EzTaxon server 2.1(http://www.eztaxon.org)、Blast程序、Mega 5.0软件进行分析并构建系统发育树。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0统计软件进行数据统计及差异显著性分析(Duncan’s新复极差法，P﹤0.05)。

2 结 果

2.1 根际放线菌的分离与拮抗放线菌的筛选

从1～5年生凤丹根际土壤中分离得到放线菌83株，经初筛有15株放线菌对腐皮镰刀菌有不同程度的抑菌作用，占全部放线菌的18.07%。13株1年生根际放线菌中4株具有拮抗作用，筛选率为30.77%；14株2年生根际放线菌中仅筛选得到一株拮抗菌，筛选率为7.14%；3年生和4年生根际土壤中均分离得到22株放线菌，且均有5株对根腐病菌有拮抗作用，筛选率均为23.81%；14株5年生根际放线菌中未筛选到对腐皮镰刀菌有抑菌作用的菌株。对初筛获得的具有拮抗腐皮镰刀菌效果的15株放线菌进行复筛，依据依据徐丽华等[14]对放线菌抑菌作用的判定，获得抑菌圈在6～15mm之间(弱作用)的拮抗放线菌8株；大于等于15mm(强作用)的拮抗放线菌4株；其余放线菌二次筛选无抑菌效果(表1)。

表1 凤丹根际拮抗放线菌抑菌作用

注：-：无抑菌效果；+：抑菌圈直径6～15mm；++：抑菌圈直径>15mm

为保证筛选菌株的抑菌稳定性，对具有强抑制作用的4株放线菌进行第三次筛选，结果如图1所示.NL4-210-46对腐皮镰刀菌抑制效果最佳，抑菌直径为19.67mm，与其余菌株之间差异显著；菌株NL1-210-35、NL3-310-44、NL4-310-35的抑菌直径分别为15.67mm、15.67mm、16.50mm，三者之间差异不显著。

2.3 拮抗放线菌发酵液对根腐病菌丝生长的影响

由图2可知，供试4株拮抗放线菌发酵液均对根腐病菌丝生长具有一定的抑制作用。其中，放线菌NL4-210-46抑菌率最大为84.38%，与其他放线菌菌株抑菌率差异显著；NL1-210-35、NL4-310-35、NL3-310-44的抑菌率分别为79.58%、78.75%、78.33%，其中NL1-210-35与NL4-310-35之间差异不显著，与NL3-310-44差异显著。

图1 拮抗放线菌对根腐病病原菌抑菌效果

图2 拮抗放线菌对根腐病病原菌菌丝体生长的影响

Fig.1 Antibiotic activity of antagonistic actinomycetes Fig.2 Inhibition of antagonistic actinomycetes on

onFusariumsolanimycelial growth ofFusariumsolani

注：柱上不同小写字母表示经Duncan’s检验在P﹤0.05水平差异显著。下同。

2.4 其它菌株抑菌效果

供试四株放线菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠球菌三种病原菌有不同程度的抑制作用，其中NL4-210-46对三种病原菌均有抑制作用，抑菌直径分别为11.50mm、13.67mm、15.17mm；NL3-310-44对三种病原菌无抑菌效果；NL1-210-35和NL4-310-35能抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌。

2.5 菌株NL4-210-46的鉴定

2.5.1 表型特征与生理生化特征 基内菌丝发达、不断裂；气生菌丝丝状，多分枝；孢子丝螺旋形，孢子长圆形，表面光滑。NL4-210-46在大多数培养基上不产生可溶性色素，气生菌丝乳白色或淡粉红，基内菌丝紫红或粉红(图3)。NL4-210-46在NaCl含量大于5%的培养基上不能生长，在pH为6.0～8.0范围内生长良好；能使明胶液化、水解淀粉，牛奶凝固胨化反应呈阳性，不能产生H2S及黑色素，不能发生硝酸盐还原反应及水解纤维素；能利用木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖等碳源，不能利用甘露醇、核糖及肌醇。

表2 拮抗放线菌对三种病原菌抑菌效果

注：表中数据为平均数±标准误

2.5.2 分子生物学鉴定 NL4-210-46用通用引物扩增后，PCR产物大小在1500bp左右，测序得出序列长度为1418bp。菌株的16SrDNA序列相似性比对后构建的系统发育树如图4所示，菌株NL4-210-46与Streptomycestauricus(公牛链霉菌)聚为一支，结合形态学特征、生理生化特征初步将菌株NL4-210-46归类为公牛链霉菌。

图4 菌株NL4-210-46系统发育树

3 讨 论

目前，中药材根腐病的拮抗放线菌筛选越来越受到关注，链霉菌属灰红紫类群是拮抗川芎根腐病病原菌的重要生防菌群[15]，Streptomycestuirus也对黄芪根腐病有较强抗菌活性[16]，王雪山等[17]从山东菏泽地区牡丹根际土壤样品中采集到1株对牡丹根腐病有良好拮抗效果的放线菌株Streptomycesalbireticuli。本研究则以道地药材基原凤丹为研究对象，从凤丹根际土壤中分离得到的83株根际放线菌，经初步筛选其中15株对凤丹根腐病菌有不同程度拮抗作用，经多次筛选共得到4株放线菌具有良好的抑菌活性，从4年生根际土壤中获得的NL4-210-46抑菌率达84.38%，经形态、理化特征及16SrDNA序列分析，鉴定其为链霉菌属公牛链霉菌。

链霉菌属因其具有产生多种生物活性代谢物和溶解酶的能力，作为植物病害生物防治剂与植物促生菌被广泛地应用研究[18]。研究表明，公牛链霉菌对大豆菌核病菌、辣椒疫病菌、石榴枯萎病菌等多种农作物病原菌具有较好的拮抗作用[19-20]。本研究对公牛链霉菌NL4-210-46的抗菌活性研究发现，该菌株在对凤丹根腐病病原菌具有较强抑菌活性的同时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠球菌也有一定的抑制作用，席楠等[21]报道指出公牛链霉菌次级代谢产物cinerubin B对金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等具有较好的抑制活性，这为本研究结果提供参考。

生防菌株能否在植株根部有效定殖决定了其生防效果的好坏[22]，本研究获得的公牛链霉菌NL4-210-46具有广谱抑菌性且对凤丹根腐病具有良好生防潜质，因此，该菌或许能提高放线菌在土壤中的定殖能力，有效解决定殖问题，并为凤丹根腐病的田间生物防治提供新的研究方向，对于该菌具体的生防机制、定殖能力以及毒理效应有待进一步研究。