肾脏纤维化的细胞和分子机制研究进展

袁 倩，刘友华

(南方医科大学 南方医院肾内科，器官衰竭防治国家重点实验室，国家肾脏病临床医学研究中心，广东 广州 510515)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，简称CKD)是一组由炎症、代谢紊乱、毒物等因素所引起的、以肾脏结构损伤和功能下降为特征的常见慢性疾病.随着人口老龄化和高血压、糖尿病等患病率的增长，慢性肾脏病的发病率已占成年人口的10%～13%[1-2].在全世界范围内，慢性肾病进展到终末期肾病(尿毒症)的人群正逐年递增.除肾脏移植或透析外，目前尚无有效的治疗手段.毋庸置疑，慢性肾病已经成为一种全球公共健康问题，严重威胁人类健康，且带来巨额经济负担.

无论病因如何，慢性肾病进展的最终归途是肾脏纤维化、疤痕组织形成和肾功能衰竭.大量的临床实践和实验数据都表明肾脏纤维化是导致肾功能逐渐丧失的主要决定因素，其病变程度与病情预后密切相关.因此，长期以来肾脏纤维化一直是国际肾脏病领域极其关注的研究热点.肾脏纤维化包括肾小球硬化以及肾间质的纤维化.在该文中，笔者仅讨论肾小管间质纤维化的细胞和分子机制.肾间质纤维化的主要病理过程包括：肾脏损伤所引发的组织微环境改变，肌成纤维细胞活化与增殖，大量细胞外基质(extracellular matrix，简称ECM)产生和沉积，肾小管萎缩和毛细血管丢失.

1 肾脏损伤与纤维化微环境的形成

肾间质纤维化通常呈不均一的局灶性分布.受损的肾脏固有细胞，特别是肾小管上皮细胞，以及免疫细胞如巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞与肥大细胞释放炎症因子、生长因子等促纤维化细胞因子，形成局部纤维化微环境，促进肌成纤维细胞活化、增殖与ECM的产生、沉积[3].

肾小管上皮细胞是最易受损的肾脏固有细胞.研究发现受损的肾小管上皮细胞分泌促纤维化细胞因子，如转化生长因子β1(TGF-β1)、Wnt以及音猬信号配体(Shh).在肾脏损伤早期，这些因子刺激成纤维细胞产生、分泌肌腱蛋白-C(TNC)[4].TNC是一种细胞外基质蛋白聚糖，通常以六聚体的形式存在.它在正常肾脏中几乎不表达，但在肾脏受损早期即被引导而高量表达.TNC是肾脏纤维化微环境的一个重要组分.TNC通过激活整合素/黏着斑激酶(FAK)/ 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促进成纤维细胞的活化、增殖以及ECM的产生与沉积.在体内敲低TNC后能抑制成纤维细胞活化与增殖，继而减轻肾脏纤维化.进一步研究发现，TNC不仅可以激活成纤维细胞内的信号通路，其独特的六聚体结构还能像海绵一样，摹集和浓缩其他促纤维化因子如Wnts，从而形成局部的、富集高浓度促纤维化因子的组织微环境，启动和加速纤维化的进展(图1[4]).

图1 TNC启动和促进肾脏纤维化组织微环境的形成

炎症细胞也是纤维化局部微环境的重要成分.CKD肾脏切片染色显示纤维化的区域可见大量炎症细胞浸润.肾脏损伤后的炎症是机体的保护机制，用于清除异物及促进损伤修复，但持续存在的炎症促进了纤维化的发生发展.巨噬细胞与淋巴细胞是参与炎症微环境的主要效应细胞.巨噬细胞激活产生两种亚型——M1型和M2型.在肾脏损伤早期，主要为M1型，它们通过产生多种炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-12(MMP-12)等，从而导致组织损伤和纤维化的发生[5].随着肾病的进展，巨噬细胞转化为M2型，通过产生并分泌TGF-β1、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、血小板源生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)和半乳凝素-3，促进成纤维细胞活化及ECM的产生[6].巨噬细胞还可以通过巨噬细胞间充质转分化(MMT)，而直接参与ECM的合成[7].

正常肾脏中淋巴细胞数量非常少，肾脏损伤后T淋巴细胞和B淋巴细胞从血液中浸润到受损部位，参与炎症微环境的形成.通过敲除小鼠重组活化蛋白(RAG1)阻碍T细胞与B细胞的成熟，能减轻输尿管梗阻导致的肾脏纤维化.而输入CD4+T细胞后，尤其是Th2细胞(辅助T细胞)后，小鼠肾脏纤维化加重[8].在衰老的肾脏，T细胞与B细胞还能与肾脏固有的成纤维细胞一起形成三级淋巴组织(TLT)，导致不可控的炎症并且延缓组织修复[9].树突状细胞(DC)不直接促进纤维化，而是通过将抗原处理后呈递给淋巴细胞，使淋巴细胞激活并产生促炎因子[10].肾脏损伤后的DC细胞激活淋巴细胞的能力增强，敲除DC细胞可延缓肾病的进展[11].另有文献报道，肥大细胞的浸润与纤维化的严重程度呈正相关，但其在肾脏纤维化中的作用仍存在争议.肥大细胞缺陷的小鼠T细胞、巨噬细胞浸润减少，肾脏纤维化减轻.然而敲除肥大细胞蛋白酶4(阻碍肥大细胞的功能)却增加T细胞和巨噬细胞浸润并加重肾脏纤维化[5].

2 肌成纤维细胞的来源和激活机制

2.1 肌成纤维细胞的来源

肌成纤维细胞(myofibroblast，简称MF)是位于肾间质的、具有平滑肌细胞与成纤维细胞特征的一群细胞，是产生ECM的主要效应细胞.MF具有特异的分子标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA).正常肾脏中没有MF，但在纤维化的肾脏中可检测到大量的MF.纤维化微环境中的促纤维化细胞因子使肾脏中多种类型的细胞转化为MF，并促进其增殖(图2).MF的来源至少有下列几种：肾间质成纤维细胞、血管旁周细胞、骨髓来源的纤维细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞.谱系追踪实验可以将同一种细胞来源的细胞带上相同的标记物，因此广泛应用于追踪MF的来源.然而，各种来源的MF占总MF的相对比例及其在纤维化中的重要性，仍存在争议[12].

图2 肌成纤维细胞的不同来源

2.1.1 成纤维细胞和周细胞的活化与增殖

肾间质固有细胞指位于肾小管之间及肾小管与管周毛细血管之间的肾脏细胞，不包括从血液循环中而来的细胞，其中包括成纤维细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSC)以及血管周细胞.在生理条件下，成纤维细胞产生一定量的ECM用于维持肾脏的结构完整性.在机械应力和促纤维化因子如TGF-β、CTGF、Shh、Wnts、PDGF和组织型纤溶酶原激活物(tPA)等[13-15]的作用下，成纤维细胞转化为α-SMA阳性的MF并大量增殖.谱系追踪研究表明成纤维细胞是MF的主要来源.近期研究证实，肾脏损伤后超过90%的PDGFR-β阳性细胞与α-SMA阳性细胞均来源于由P0阳性细胞分化而来的成纤维细胞[16].LeBleu等[17]也证明单侧输尿管梗阻(UUO)肾脏中50%的MF来源于肾脏固有成纤维细胞.

周细胞位于血管周围，用于维持肾小管周围毛细血管的完整性.Humphreys等[18]证明超过90%的MF来源于由FoxD-1阳性细胞分化而来的周细胞.该结论与P0阳性细胞谱系追踪实验结论相矛盾.可能的原因是P0在FoxD-1阳性细胞分化的某个阶段重新表达，使这两种细胞来源的后代细胞存在重叠.LeBleu等[17]认为周细胞仅占MF前体细胞的6%.两个研究结论存在差别的解释可能是所用的周细胞标记物与实验方法不同.

MSC具有自我更新和多项分化潜能，与周细胞一起维护血管完整性.近期研究表明55%的MF来源于Gli1阳性的MSC细胞[19].敲除Gli1阳性细胞，或抑制Gli1阳性细胞的增殖，能明显缓解UUO所致的肾脏纤维化[20].需要指出的是，活化的成纤维细胞也表达Gli1.

2.1.2 上皮间充质细胞转分化

上皮间充质细胞转分化(epithelial mesenchymal transition，简称EMT)是指上皮细胞失去上皮特有的功能和标志如钙黏附蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)，出现间充质细胞的标志如波形蛋白(vimentin)、α-SMA[21].内皮细胞是一种特殊类型的上皮细胞，毛细血管内皮细胞通过类似于EMT的内皮细胞间充质转分化(EndoMT)过程，转变为MF.细胞在体外发生EMT被广泛接受，但体内是否存在EMT颇有争议.支持体内EMT的证据有：体内研究证明上皮细胞能跨过肾小管基底膜进入肾间质[22]；谱系追踪实验证明36%的MF来源于肾小管上皮细胞[23]；干预EMT过程能延缓肾纤维化的进程[24].反对EMT的证据主要是通过谱系追踪方法无法证明上皮细胞能转变为MF[17-18].近期研究提出“部分EMT”的概念[25-26]，更好地解释之前存在的争议.部分EMT是指上皮细胞获得间充质细胞的部分特征，但并未完全转化为MF.在此过程中，受损的肾小管上皮细胞下调上皮的标志蛋白，细胞周期阻滞在G2/M期，分泌促纤维化因子及表达α-SMA.转录因子Snai1和Twist1是介导此过程的关键调控因子.部分EMT表明，上皮细胞虽未通过EMT转变为MF，但其表型转变已经足够影响纤维化的进程.

2.1.3 骨髓来源的细胞

血液循环中的单核细胞及纤维细胞可转化为MF.纤维细胞是指外周血中骨髓来源的、具有成纤维细胞特征的一类单核细胞，其表达造血细胞的标记蛋白CD45及某些趋化因子受体如CCR7.肾脏组织损伤时，纤维细胞迁移浸润到肾间质并参与纤维化过程.研究表明在缺血再灌注模型(IRI)及UUO模型中，约20%的MF来源于纤维细胞[27].炎症细胞如CD4+T细胞以及促纤维化因子如IL-4和IL-13促进纤维细胞分化，而IFN-γ 和IL-12抑制此过程.近期研究表明单核/巨噬细胞也可通过MMT，转分化为MF[7].直接或间接敲除骨髓来源的细胞可缓解15%～50%的肾脏纤维化[28].

2.2 肌成纤维细胞的异质性

许多实验表明α-SMA阳性的MF不是一个均一的细胞群体，它们具有很强的异质性.不是所有产生Ⅰ型胶原的细胞都表达α-SMA.同样，α-SMA阳性的MF不一定都活跃地产生胶原蛋白.这种异质性可能是因为MF来源于不同的前体细胞，并且它们的表型是动态变化的.

MF的异质性也是导致本领域诸多争议的潜在原因.由于激活的成纤维细胞缺乏特异性的标志物，对它们的来源、构成比例、产生胶原的能力，不同学者的结论就不尽相同.虽然一些蛋白作为激活的成纤维细胞标志物而广泛应用于肾脏纤维化的研究领域，例如α-SMA、vimentin、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fsp-1)和PDGFRβ，但需要指出的是所有这些标志物都不具有特异性，并且它们的表达随着时间和纤维化的进程而动态变化.

随着新技术和研究方法的不断发展，人们对MF的异质性必将有更深入的认识.可以想象，随着单细胞RNA测序的广泛应用以及各种组学的发展，各种MF亚群的组成、动态变化和相对消长将被阐明.

2.3 肌成纤维细胞激活的分子机制

MF的激活受到一系列促纤维化因子的调控.这些因子通过自分泌和旁分泌途径影响各种来源的MF活化，并产生大量的胶原蛋白，从而导致肾脏纤维化.

2.3.1 TGF-β信号通路

TGF-β是目前公认的促进纤维化的关键细胞因子，在MF的活化中起着重要的作用.在经典的TGF-β/Smad信号通路中，活化的TGF-β1直接与TGF-β受体II结合.激活的TGF-β受体II募集TGF-β受体I，导致Smad2和Smad3的磷酸化.活化的Smad2/3与Smad4结合，使整个复合物转移到细胞核中以增加纤连蛋白、α-SMA、胶原蛋白基因的转录[29].TGF-β1还可激活Smad非依赖的MAPK信号通路，包括ERK、JNK、p38.而p38也可通过上调TGF-β1，进一步活化Smad2与Smad3，从而激活MF.此外，TGF-β信号通路也是多种促纤维化因子，如PDGF、血管紧张素II、CTGF等激活MF的重要媒介.

2.3.2 Wnt/β-catenin信号通路

大量研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化发生发展过程中发挥着重要的作用.Wnt配体与膜受体结合，抑制β-catenin降解，从而使其处于持续活化状态，继而进入细胞核激活靶基因的转录.肾素和肾素原受体(prorenin receptor，简称PRR)是Wnt信号通路的下游靶基因，并且是Wnt信号通路的放大器[30].肾素血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，简称RAS)中所有组分均是β-catenin的下游靶基因[31-32]，而RAS组分的上调可增加活性氧(ROS)、TGF-β1的产生.除RAS外，纤连蛋白、成纤维细胞特异性蛋白(Fsp1)、转录因子Snail-1、基质金属蛋白酶7(MMP7)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)[33]等均是Wnt/β-catenin下游靶基因[34-35].Snail-1是上皮细胞发生部分EMT的主要介导因子，MMP-7可降解E-cadherin，PAI-1可增加TGF-β1的表达并募集炎症细胞.Wnt/β-catenin信号通路通过调控这些靶基因，从而影响肾脏纤维化的进程.因此，阻断Wnt/β-catenin信号通路，可能是一种防止MF活化、有效抑制纤维化进展的新策略.笔者课题组的研究显示，β-catenin特异的小分子抑制剂ICG-001或抗衰老蛋白Klotho，通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，明显减轻肾脏纤维化[35-36].

2.3.3 其他促纤维化信号通路

Hedgehog信号通路通过hedgehog配体与Ptch受体结合，从而解除Ptch对Smo蛋白的抑制作用.活化的Smo促进转录因子Gli入核，并调控下游靶基因.研究表明，肾脏损伤后，Shh被诱导，主要表达在肾小管上皮细胞.但它能特异地靶向作用于成纤维细胞，引起它们的活化和增殖[37].因此，Hedgehog信号通路能通过介导肾小管上皮细胞与间质成纤维细胞间的交流，从而促进成纤维细胞激活与增殖[13].除上述主要的促纤维化因子外，还有多种因素参与了MF的激活，如ROS、炎性介质、CTGF、血管紧张素II和某些ECM组分等.

3 细胞外基质的合成、分泌、组装和沉积

ECM是位于肾间质的非细胞性支架结构，为肾小管和毛细血管提供物理支持，在生理情况下调控组织稳态[38].ECM是动态变化的，病理性ECM的成分、结构与生理性的ECM不同.ECM富含纤维蛋白、基质蛋白、蛋白聚糖和其他促纤维化的细胞因子[39].纤维蛋白构建起ECM的框架，是ECM的主要成分.纤维蛋白主要包括I和III型胶原蛋白(Collagen)、纤连蛋白(Fibronectin)和弹性蛋白(Elastin).

TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch等与生长发育相关的信号通路，不仅介导MF的活化，而且还在转录水平上促进ECM蛋白如胶原蛋白、纤连蛋白等的合成.这些信号通路通过下游的转录因子如Smad3、β-catenin可以直接调控ECM蛋白的表达，也可以通过通路间的关系网络，互相促进ECM的产生.多种microRNA或lncRNA也通过直接调节ECM的产生，或通过调节这些信号网络，而间接调控ECM的表达.为防止ECM的过度产生，机体本身存在抗纤维化的信号通路.如肝细胞生长因子(HGF)和骨形态发生蛋白7(BMP-7)，主要通过拮抗TGF-β信号通路发挥抑制纤维化的作用.ECM的积累取决于促纤维化和抗纤维化信号通路之间的平衡.通常在损伤的肾脏中，促纤维化的细胞因子及其信号通路如TGF-β1、Wnt和Shh上调，而抗纤维化的因子如HGF和BMP-7下调，导致促纤维化信号通路作用占据优势[40]，ECM产生增多.

过量的ECM在细胞外组装时需要整合素相关蛋白复合体的介导.整合素是一个穿膜受体，其将细胞外ECM的信号传递给细胞内下游的FAK和整合素相关激酶(ILK).ILK作为支架蛋白，在细胞内与PINCH、Parvin形成复合物[41].PINCH通过与Nck2结合将整合素通路与酪氨酸激酶通路联系起来，建立起细胞内信号通路网络；而Parvin结合在细胞骨架蛋白F-肌动蛋白上，将ECM与细胞更牢固地联系在一起.干扰该复合体的形成或ILK的活性均可减少纤连蛋白的产生、组装和沉积[42-43].除整合素相关蛋白复合体外，ECM还通过MF细胞膜上丰富的电子致密斑Fibronexus与MF中肌动蛋白微丝连接[44].

ECM的胞外沉积决定于其产生以及降解的速度.基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, 简称MMP)是介导ECM降解的主要酶类，可剪切ECM中的多种成分.MMPs主要通过分泌释放到细胞外，经蛋白酶剪切或硫醇基氧化激活.除MMPs外，降解ECM的金属蛋白酶还包括去整合素金属蛋白酶(ADAMs)、血小板反应蛋白去整合素金属蛋白酶(ADAMTS)和穿膜肽酶(Meprins)[38].金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是金属蛋白酶的负向调节因子，防止生理状态下ECM的过度水解.在纤维化时表达增加，抑制蛋白酶对ECM的降解.在纤维化的早期，ECM容易被降解，此时的纤维化是可逆的.但随着纤维化的进展，转谷氨酰胺酶(TGs)和赖氨酰氧化酶样蛋白(LOXL)介导胶原蛋白的过度交联，形成胶原纤维[45].机械应力也加速纤连蛋白与胶原蛋白之间的相互作用[46]，导致ECM硬度增加，组织弹性降低，难以被蛋白酶降解.促纤维化因子使多种不同来源的细胞转分化为MF，并大量增殖，导致ECM的产生明显增加；与此同时ECM的降解速度减低，导致ECM大量沉积在肾间质.

4 肾小管和毛细血管损伤与疤痕组织形成

肾脏病中受损的肾实质细胞通常根据病因的不同而异.当病因是肾小管毒物、梗阻、缺血等因素时，肾小管上皮细胞是首当其冲的受害者，继而发展为肾间质纤维化[47].损伤导致上皮细胞中转录因子Snai1和Twist1激活，触发部分EMT.同时细胞周期被阻滞在G2/M期，而在这种阻滞状态下，多种促纤维化的细胞因子将被释放.肾小管上皮细胞Wnt9a异常上调，导致上皮细胞衰老[48].脂肪酸氧化(FAO)是肾小管上皮细胞的主要供能途径.FAO失调导致脂肪酸代谢紊乱、上皮细胞ATP损耗、细胞死亡和去分化.这些过程包括部分EMT、细胞衰老和脂质代谢失调，共同导致肾小管上皮细胞失去上皮细胞的滤过、重吸收功能及上皮细胞的标记物，呈现分泌性表型(图3)[49].受损的肾小管上皮细胞分泌TGF-β、Wnt、Shh、PDGF、CTGF、血管紧张素II、内皮素-1和病理性外泌体等促纤维化因子，从而引起MF的活化、增殖和ECM的产生、组装、沉积(图3)[50-51].损伤导致毛细血管内皮细胞凋亡或经EndoMT转化为肌成纤维细胞，以及滋养毛细血管的周细胞转化为肌成纤维细胞等病理变化，破坏毛细血管完整性.受损的内皮细胞通过Notch与Wnt信号通路激活成纤维细胞[52].毛细血管内皮细胞损伤所致的毛细血管稀疏化，进一步加重组织的缺氧损伤.而缺氧可导致上皮细胞线粒体损伤，促进肾小管萎缩，阻碍肾小管的修复，加速上皮细胞产生ECM.缺氧还可加重炎症损伤并促进成纤维细胞产生ECM[53].综上所述，肾小管上皮细胞与毛细血管内皮细胞不仅仅是损伤的受害者，而且是肾纤维化进展的驱动力.

图3 肾小管上皮细胞损伤与成纤维细胞的激活

纤维化与肾小管的萎缩往往伴随出现.纤维化表现为大量的ECM沉积在肾小管间或肾小管与毛细血管之间，这使肾小管与管周毛细血管距离增大，阻碍肾小管从毛细血管中获取营养物质和氧，加重肾小管的损伤.ECM组分血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1)促进TGF-β的活化并抑制血管生成，进一步加重缺氧损伤.敲除thrombospondin-1后，血管内皮生长因子(VEGF)表达上调使毛细血管内皮细胞存活并增殖，进而减轻肾脏纤维化[54].肾小管和毛细血管内皮细胞的损伤与肾脏纤维化相互促进，形成恶性循环，最终导致肾脏正常结构的破坏，加速疤痕组织的形成.

5 结束语

肾脏纤维化是一个非常复杂的动态过程，其中涉及几乎所有类型的肾脏固有细胞以及免疫细胞.经过近年来的研究，我们对于肾脏纤维化过程中组织微环境的形成、MF的来源与活化机制、上皮细胞和血管内皮损伤对纤维化的影响，有了更深入和更全面的认识.阐明肾脏纤维化的细胞及分子机制是研发抗纤维化的有效药物以及开展早期诊断的基础，这一复杂的过程仍有许多重要问题亟须解决.尽管如此，我们有理由相信，有关肾脏纤维化机制的研究，最终必将能转化成更有效的临床治疗策略，造福于广大患者.