miRNA-350靶向MAPK14及JNK调控H9c2细胞增殖和凋亡

张淑华 洪 浪 王云霞 吴志婷 刘秋玲 葛郁芝

(江西省人民医院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

细胞凋亡是指机体在有害物质、破损细胞等体内外诱导因素下激活细胞内某些编码基因而导致的细胞死亡，是程序性死亡的一种〔1〕。microRNA(miR)通过对靶基因转录后表达调控，广泛参与细胞的增殖、分化、病变、修复和凋亡等多种生命活动〔2〕。大量研究表明miRs参与急性心肌梗死、缺血再灌注、氧化应激等多种情况下心肌细胞凋亡的调控〔3～5〕，另有报道肥大的心肌细胞更容易发生凋亡〔6〕。从压力超负荷心肌肥厚大鼠的心肌组织中筛选到异常表达的miR-350〔7〕，并对其作用机制进行探索，研究过程中发现miR-350引起细胞肥大的同时，心肌细胞凋亡也增加。该现象是否和miR-350有直接关系呢？心肌细胞为终末分化细胞，不具有再生和增殖能力，而大量心肌细胞凋亡，死亡是多种心血管疾病导致的心脏功能损害由代偿性向失代偿转变的重要因素〔8〕。明确心肌细胞凋亡机制对心血管疾病的预防与治疗有着重要意义。本研究利用特殊化学修饰的miR拮抗剂抑制miR-350的表达，从正反两个方向深入研究。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠胚胎心肌细胞H9c2细胞购自ATCC；杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)、胰酶、抗生素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)等购自Gibco公司。胎牛血清购自PAA公司，FuGene HD购自Roche公司，Trizol购自Invitrogen公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，RNasin和dNTP购自TaKaRa公司。AnnexinV-PE凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司，核酸序列均由上海生工合成。miR-350基因序列：GTGAAAGTGTATGGGCTTTGGGAATTCAAGAGATTCACA AAGCCCATACACTTTCAC；miR-350拮抗剂(antagomir)序列：5′-GUGAAAGUGUAUGGGCUUUGUGAA-3′ (miR-350 anti)。miR-350突变(mutant)序列：5′-GUCAAUGUGAUAGCGCUCACGUAA-3′(miR-350-NC)。

1.2细胞培养和转染 H9c2细胞常规培养于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的DMEM培养液中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。细胞转染前1 d换成无双抗的培养基。选用转染试剂FuGene HD将含miR-350及相关核酸的载体及shRNA-JNK/p38转染H9c2细胞。细胞分组：对照(Control)组(未处理的H9c2细胞)；Mutant组(H9c2细胞转染miR-350突变序列过表达载体)；miR-350组(H9c2细胞转染miR-350过表达载体)；shRNA-JNK/p38组(H9c2细胞转染shRNA-JNK/p38过表达载体)；miR-350+anti组(H9c2细胞共转染miR-350和miR-350 antagomir)；血管紧张素(Ang)Ⅱ组(AngⅡ处理H9c2细胞)。

1.3细胞表面积的检测 上述各组细胞分别于处理后1、3、5、7 d拍照，并应用Image J软件分析细胞心肌细胞表面积。

1.4MTT法检测细胞相对活力 H9c2细胞种于96孔板，按上述方法进行分组，分别转染2 μg Mock、miR-350和shRNA-JNK/p38质粒及给药AngⅡ(1 mg/ml)1、2、3、4、5 d后，细胞用胰酶消化重悬，细胞悬液用0.4%(g/ml)的台盼蓝等体积稀释，取10 μl加到细胞计数板，静置3 min，显微镜下计数。细胞数/ml=(4大格细胞总数/4)×10 000×稀释倍数。并用紫外分光光度计测定A540，计算细胞相对活力百分比。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 H9c2细胞种于6孔板，分别转染2 μg Mutant、miR-350质粒，给药AngⅡ(1 mg/ml)，于第3天用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次(2 000 r/min离心5 min)，收集(1～5)×105细胞，用500 μl的结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-PE对细胞染色。室温、避光、静置5～15 min后；将细胞悬液混匀；于1 h内，进行流式细胞仪的检测。

1.6miR-350对细胞p38和JNK基因表达影响 用miR-350 antagomir和miR-350共转染H9c2细胞，试图阻滞miR-350的活性，观察靶基因p38和JNK的表达变化。细胞分四组：Control组、miR-350组、miR-350+anti共转染组和shRNA-JNK/p38组。常规消化收集处理48 h的细胞，提取总蛋白和总 RNA，分别行Western印迹和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测JNK和MAPK14的蛋白和mRNA表达。蛋白印迹实验的胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。PCR产物在质量分数2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像并测定光密度值(A值)，以β-肌动球蛋白(actin)为内参照，将AJNK/Aβ-actin及AMAPK14/Aβ-actin的比值进行统计学分析。实验重复3次。

1.7统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-350 诱导H9c2细胞肥大 与Control组相比，转染第7天，AngⅡ组和shRNA-JNK/p38组细胞发生肥大(P<0.05)；miR-350组细胞肥大显著(P<0.01)；而miR-350+anti组及Mutant组细胞未见明显变化(P>0.05)。见表1。

表1 各组H9c2细胞加药处理后不同时间点细胞相对大小的变化

与Control组比较:1)P<0.05，2)P<0.01;下表同

2.2miR-350 抑制细胞增殖 转染miR-350和shRNA-JNK/p38后1～5 d，细胞活力呈时间依赖性下降。与Control组相比，转染后3～5 d miR-350组细胞活性显著下降(P<0.05)；shRNA-JNK/p38组细胞活性抑制最为显著(P<0.01)；而miR-350+anti组、Mutant组及AngⅡ组细胞活性均未发生明显变化(P>0.05)。见表2。

2.3miR-350诱导H9c2细胞凋亡 心肌细胞转染miR-350组、shRNA-JNK/p38组、miR-350和miR-350 anti组及AngⅡ组细胞处理60 h后，各组细胞通过Annexin V和PI共染色法测定细胞凋亡情况。Control组细胞凋亡率为0.06%，miR-350+anti组细胞凋亡率为0.79%，AngⅡ诱导组细胞的凋亡率是2.4%，shRNA-JNK/p38组和miR-350组的凋亡率分别是16.36%和8.39%；与Control组相比，miR-350和shRNA-JNK/p38组凋亡率显著提高(P<0.05,P<0.01)。见图1。

2.4miR-350 对H9c2细胞p38和JNK的表达影响 miR-350的过表达可在转录水平抑制内源性p38和JNK基因的表达。而且，miR-350-anti能够明显抑制miR-350活性，阻止miR-350对靶基因的影响。与Control组相比，miR-350+anti组细胞p38和JNK基因和蛋白质均无显著变化。见图2。

表2 各组H9c2细胞加药处理后不同时间点细胞相对活力

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

图2 各组靶基因p38和JNK的表达水平PCR和Western印迹结果

3 讨 论

本研究前期结果显示miR-350通过抑制靶基因p38和JNK的表达，影响NFATc的转核介导心肌肥大〔9，10〕。研究过程中发现miR-350抑制H9c2细胞肥大的同时，细胞增殖受到抑制，死亡细胞增多。p38和JNK的信号转导通路是MAPK通路的一个重要分支，它在细胞周期、生长、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用〔11〕。细胞凋亡的增加和心肌肥厚和心衰有关。

为了从正反两个方面探索miR-350和凋亡的关系，将miR-350 antagomir与miR-350过表达载体共转染H9c2细胞，抑制miR-350的表达。结果如预期一致，转染miR-350-anti的细胞miR-350表达水平受到明显抑制，而p38和JNK基因表达水平无变化；从细胞大小定量分析的结果可以发现，miR-350-anti明显改善了miR-350导致的细胞肥大；并且有效地阻止了miR-350引起的细胞凋亡。这些结果均表明，miR-350诱导心肌细胞病理性肥大的同时，可以促进细胞凋亡。miR-350这种生物学活性可以有效地被miR-350 antagomir阻滞。

推测miR-350诱导H9c2细胞凋亡，也是通过抑制靶基因p38和JNK的表达介导的。miR-350引起心肌细胞凋亡可能是扩张型心肌病及心力衰竭晚期的一个重要因素，miR-350导致的细胞凋亡在调节肥厚反应和随后心力衰竭的进展中起至关重要作用。调控miR表达可以有效影响心肌细胞凋亡进程，为心血管疾病的预测、诊断与治疗提供了新的思路。