补中益气汤在转移性乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用及机制

董合玲 谭庆麟 叶志彬 叶兆康 卢志斌 李 浩 张汉文 吴 敏 吴依芬

(暨南大学体育学院，广东 广州 510632)

乳腺癌位于女性癌症之首〔1，2〕。乳腺癌发展到一定阶段后，会有不同程度的转移。转移性乳腺癌(MBC)是癌肿经过直接浸润蔓延或淋巴管、血管等途径转移至其他器官并继续增殖生长，形成与原发瘤同样性质的癌肿。MBC患者治疗后生存时间较长，因此MBC患者的治疗至关重要。三苯氧胺(他莫昔芬，TAM)是最基本的内分泌治疗药物，但TAM治疗过程中，除了原发耐药(TAM-R)之外〔3〕，约30%最终产生继发耐药〔4〕，导致治疗失败，治疗失败后采取化疗副作用大，过程痛苦。因此，探索乳腺癌内分泌耐药的机制，寻找抑制内分泌耐药的有效药物是迫切需要解决的问题。本文研究补中益气汤逆转TAM-R而抑制乳腺癌细胞生长的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系，美国ATCC株亚型)；二甲基亚砜(DMSO)、焦碳酸二乙酯(DEPC，美国Sigma公司)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，MBCHEM公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；TAM(Hoffman-La Roche公司)；补中益气汤(根据《中华人民共和国药典》制备)；引物合成(美国Invitrogen公司)；放射免疫沉淀实验(RIPA)裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SYBR premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司)。

1.2实验方法 MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，待细胞铺满皿底面积的90%以上时，取生长状态好的细胞传代。正式实验时，细胞平均种于35 cm六孔板中，以减少组间差异。实验分5组，分别为MCF-7、MCF-7+TAM、MCF-7+补中益气汤、MCF-7/TAM-R、MCF-7/TAM-R+补中益气汤。TAM用量为5 μg/ml，TAM培养液持续培养6个月以上，即诱导产生耐TAM人乳腺癌细胞系MCF-7/TAM-R。补中益气汤用量为1.5 μg/μl。

1.3MTT检测细胞存活率 各组细胞贴壁后，根据分组药物处理18 h，倒置显微镜下观察。然后加入5 mg/ml浓度的MTT溶液，继续培养4 h。反应末，去除培养基加入150 μl的DMSO低速振荡10 min后酶标仪测量吸光度。根据公式计算结果，进而评价各组细胞的存活率。

1.4Western印迹检测雌激素受体(ER)、血管内皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体(HER)-2、Akt蛋白含量 各组细胞加入200 μl蛋白裂解液〔50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1 mmol/L二硫代苏糖醇(DTT)，0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)，25 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na3VO4，100 mg/L苯甲基硫酸氟(PMSF)，2 μg/ml亮抑酶肽，1 μg/ml抑肽酶〕，冰上裂解15 min后收样，分装保存在-80℃。Bio-Rad 测定提取上清液中的蛋白质浓度，加上样缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，2% SDS，10%丙三醇，2%β-巯基乙醇和0.5‰溴酚蓝)，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，1×三羟甲基氨基甲烷(TBS)液洗涤3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗涤3次。电化学发光(ECL)试剂盒显色，KODAK Image Station 4000MM 图像系统曝光，分析读取条带面积，宽度和灰度值。

1.5qRT-PCR检测ER、EGFR、HER-2、Akt的mRNA表达 “Primer-Premier 5”软件设计引物。Trizol 试剂盒提取各组细胞的总mRNA，溶于适量DEPC水后分装，取适量测其纯度和总量，其余于-80℃冰箱保存。使用反转录仪将RT反应液中的RNA反转录为cDNA，反应条件：37℃15 min；85℃5 s；4℃30 min。将反转录好的cDNA于-80℃冰箱保存。PCR操作按照试剂盒说明书进行。PCR反应液混匀后在荧光PCR仪上扩增目的基因：95℃预变性30 s一个循环，然后执行(95℃变性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s)45个循环，最后72℃再延伸5 min，反应结束后，采用55～95℃间隔1℃ 2 s进行融解曲线分析。

1.6统计处理 采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1补中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞存活率 MCF+TAM组和MCF+补中益气汤组细胞存活率〔(51.1±0.79)%、(59.2±0.28)%〕较MCF-7组〔(83.3±0.62)%〕显著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R组细胞存活率〔(82.7±0.53)%〕与MCF-7组无显著差异。MCF-7/TAM-R补中益气汤组细胞存活率〔(44.5±0.36)%〕显著下降(P<0.05)。

2.2补中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞后蛋白量 MCF-7+TAM组和MCF-7+补中益气汤组ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量较MCF-7组显著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R组与MCF-7组相比，HER-2、Akt、EGFR和ER蛋白量有所上升，无显著差异。MCF-7/TAM-R+补中益气汤组ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量均下降。见图1和表1。

图1 补中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞机制蛋白表达

表1 补中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞机制蛋白表达

与MCF-7组相比:1)P<0.05，下表同

2.3中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞后基因表达变化 MCF-7+TAM组和MCF-7+补中益气汤组ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表达较MCF-7组显著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R组与MCF-7组相比，HER-2和Akt mRNA有所上升，EGFR和ER mRNA表达下降均无显著差异。MCF-7/TAM-R+补中益气汤组ER、EGFR、HER-2及Akt mRNA表达均显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 补中益气汤干预MCF-7/TAM-R细胞基因表达

3 讨 论

乳腺癌发展到一定阶段后进展为MBC。但是，TAM治疗过程中，除了原发耐药之外〔3〕，约30%最终产生继发耐药〔4〕，导致治疗失败。大量临床研究表明，ER失调和过表达EGFR/HER-2是造成TAM-R的重要机制〔5～7〕；PI3K/AKT/mTOR通路是在ER交互作用中的重要通路，抑制Akt可以抑制ER和EGFR/HER-2的交互作用〔8～10〕。

乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗、化疗放疗、运动疗法、中医疗法、分子靶向治疗等〔11，12〕。中药疗法或运动干预与分子靶向治疗的有机结合可提高肿瘤的治疗效果〔13～16〕。中医对于治疗乳腺癌的病理机制及发展过程早有记载。补中益气汤是“益气升阳”的代表方，方中重用黄芪，配伍人参、炙甘草、白术等诸药，功用补益脾气、升阳举陷、甘温除热，使元气充盛，清阳上升，是临床上治疗脾胃气虚证的一条有效处方。

补中益气汤通过下调ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表达及蛋白含量，而逆转了MCF-7细胞对TAM耐药，从而进一步促进了乳腺癌细胞的凋亡，达到控制乳腺癌的效果。