SR-B1信号通路介导银杏叶提取物对内皮细胞的抗血栓作用

何志军 李媛彬

（湖南中医药高等专科学校 湖南 株洲 412012）

动脉粥样硬化性疾病严重威胁着人类的健康，在发达国家被称为“头号杀手”。低密度脂蛋白（LDL）与动脉粥样硬化的多个发展过程有联系。LDL在氧化应激状态下形成致动脉粥样硬化的oxLDL，oxLDL能引起内皮功能紊乱及促进血栓因子的分泌和血小板聚集，具有高度的致动脉粥样硬化的作用，动脉粥样损伤病灶中已发现有oxLDL的存在。而高密度脂蛋白通过恢复内皮细胞中被LDL等导致动脉粥样硬化的脂质削弱了的一氧化氮（NO）合成，间接地抑制了血小板的聚集。Valiyaveettil M[1]等认为高密度脂蛋白对血小板活化的抑制作用取决于高密度脂蛋白中的载脂蛋白E，因为载脂蛋白E 能够与血小板表面的SR-B1受体结合，激活血小板内的内皮型eNOS，从而诱导血小板合成NO，使血小板活化受到抑制。

国内外的一些研究表明，从银杏叶中提取的药用有效成份主要为黄酮及银杏内脂等，简称银杏叶提取物（GbE）[2]，具有明显的抗氧化活性、抗自由基活性、改善微循环、降低血液粘度、降低Ca2+内流、抑制血小板聚集等多种作用[2，3]，但具体抗血栓形成机制尚不清楚。本实验研究GbE对oxLDL诱导的血管内皮细胞抗血栓功能改变及内皮型eNOS的活化是否与SR-B1介导的细胞内信号通路激活有关。

1.材料与方法

1.1 材料

HUVECs株原代培养，DMEM培养基、胎牛血清（FBS）均为Gibco/BRL产品；TXA2、P-选择素酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒（TRIzol）购于美国Invitrogen公司；逆转录及实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；eNOS活性检测试剂盒购自南京建成科技有限公司；各种抑制剂均购自美国cell signaling公司；实时荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad IQ5。

1.2 研究方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞培养

HUVECs用含10%FBS的DMEM培养基培养，细胞汇集成单层达80%，0.01% 胰酶37℃消化5min，以1×105个接种于6孔板，贴壁24 h，换无血清培养基培养24h，然后按实验设计分组处理。

1.2.2 酶联免疫吸附实验法检测P-选择素和TXA2含量

常规以消化法传代培养细胞，将等量细胞悬液分别接种于24孔培养板上，调整细胞含量为5×105/孔，待细胞长成单层贴壁后，分组后取细胞培养液上清离心，再收集上清置于-20℃保存，然后按P-选择素ELISA试剂盒说明操作，置于酶标仪在450nm处测定吸光度，每组设6个复孔，取平均值。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析

总RNA提取：细胞分组处理，在6孔培养板中加入0.8mL Trizol核酸裂解液，按一步法提取细胞总RNA。用紫外分光法测A值进行定量，并计算A260/A280值，提取的总RNA比值在1.7～2.0，表明所得总RNA完整。

RT-qPCR：（1）逆转录（RT）：用TaKaRa的PrimeScript RT regent Kit进行逆转录反应，分别加入总RN A、AMV 逆转录酶和逆转录反应体系进行RT反应。（2）实时定量PCR（q PCR）：加入PCR反应体系、上下游引物、超净水进行PCR 反应。SR-B1上游引物为5′-GGTCCAGAACATCAGCAGGATC-3′，下游引物为5′-GCCACATTTGCCCAGAAGTTCC-3′；eNOS上游引物为5′-GAAGGCGACAATCCTGTATGGC-3′，下游引物为5′-TGTTCGAGGGACACCACGTCAT-3′，反应条件为：95℃，3min；95℃，10s；56℃，10s；72℃，30s，40个循环；65℃，30s；70℃，30s。反应结束后根据获取的循环阈值（ct值），釆用相对定量的方法计算2-△△ct分析数据作图。目标检测的表达以内参进行标准化。

1.2.4 内皮细胞eNOS活性测定

分组处理后收集各组内皮细胞，加匀浆缓冲液后匀浆离心，制备内皮细胞匀浆液。然后用考马斯亮蓝G-250染色法进行蛋白定量，用匀浆液缓冲液进行样品配平。加入eNOS反应液置37℃水浴30min，煮沸5min终止反应，离心后取上清液测定单位时间内一氧化氮代谢产物（NOx）的产生量。NOx的测定采用高效液相色谱分析法（日本LC-2010AHT）。Macherey-Nag el离子柱（250mm×4.6mm，Nucleo sil100-5SB），紫外检测器测定214nm处的吸光度。标准品：亚硝酸钠。

1.3 统计学处理

应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，所得数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（one way-ANOVA），组间比较采用方差分析及t检验，P＜0.05为差异，有统计学意义。

2.结果

2.1 GbE对oxLDL诱导的内皮细胞分泌P-选择素、TXA2的影响

oxLDL（50μg/mL）刺激细胞24h后，与空白对照组比较，培养液中P-选择素、TXA2水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；GbE呈浓度依赖性抑制oxLDL对内皮细胞P-选择素、TXA2分泌的促进作用，尤其以200mg/L更为显著（P＜0.05）（表1）。提示GbE在oxLDL诱导的内皮细胞功能改变中具有重要作用。

表1 GbE对oxLDL刺激内皮细胞p-选择素和TXA2水平的影响（±s，n=6）

表1 GbE对oxLDL刺激内皮细胞p-选择素和TXA2水平的影响（±s，n=6）

与对照组比较：*P＜0.05；与oxLDL组比较：△P＜0.05。

Group mg/L p-select（ng/L） TXA2（ng/L）Control / 13.34±0.35 19.28±3.38 oxLDL / 256.46±5.89* 86.74±2.56*OxLDL+GbE 50 148.84±3.22* 53.71±3.42*100 89.96±3.39*△ 33.58±4.86△200 45.37±1.09△ 24.66±2.83△400 49.86±1.23 28.32±2.35

2.2 GbE对oxLDL诱导的内皮细胞eNOS 活性的影响

从表2可见，与空白对照组相比，oxLDL（50μg/mL）降低内皮细胞eNOS 活性及NO的释放，差异有统计学意义（P＜0.05）；与oxLDL组相比，GbE组在浓度为50、100、200μmol/L时，呈剂量依赖性的增加内皮细胞eNOS活性及NO的释放（P＜0.05）。当GbE浓度超过200μmol/L 时，其作用持平。

表2 不同浓度的GbE对内皮细胞eNOS 活性的影响（±s，n=6）

表2 不同浓度的GbE对内皮细胞eNOS 活性的影响（±s，n=6）

与对照组比较：*P＜0.05；与oxLDL组比较：△P＜0.05。

Group mg/L NOx（pmol/50ul） eNOS activity percentage（%）Control / 161.32 ±23.13 100 oxLDL / 38.34±0.89* 23.6 OxLDL+GbE 50 64.24±5.78*△ 40.1 100 113.54±18.93△ 70.1 200 141.24±20.81△ 86.0 400 139.72±19.36 86.3

2.3 GbE对oxLDL诱导的内皮细胞SR-B1和eNOS的mRNA表达的影响

与空白对照组相比，oxLDL（50μg/mL）降低SR-B1、eNOS mRNA的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；与oxLDL组比较，GbE（200mg/L）可以抑制oxLDL对SR-B1、eNOS mRNA的影响，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A、1B。

图1 GbE对oxLDL刺激内皮细胞SR-B1和eNOS mRNA表达的影响（±s，n=4）与对照组比较：*P＜0.05；与oxLDL组比较：#P＜0.05。

2.4 SR-B1介导的信号分子对GbE增加内皮细胞eNOS 活性的影响

GbE（200mg/L）与oxLDL（50mg/L）共孵育组内皮细胞eNOS 活性较oxLDL组明显增加（P＜0.05）；在加入GbE的同时加入SR-B1阻断剂BLT4（100 µmol/L）、Akt强效抑制剂1L-6-hydroxy methyl-chiro-iositol-[（R）]-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate（25µmol/L）以及PI3K强效特异性抑制剂AS-605240（80µmol/L）后，均能部分抑制GbE对内皮细胞eNOS 活性的增加（P＜0.05），见表3。

表3 SR-B1介导的细胞内信号分子对GbE诱导的内皮细胞eNOS 活性影响 （±s，n=6）

表3 SR-B1介导的细胞内信号分子对GbE诱导的内皮细胞eNOS 活性影响 （±s，n=6）

与对照组比较：*P＜0.05； 与oxLDL组比较：△P＜0.05；与oxLDL+GbE组比较：△△P＜0.05。

Group dose eNOS activity（pmol/50ul）Control / 161.32±23.15 oxLDL / 38.31±0.56*oxLDL+GbE 200mg/L 136.68±18.93△oxLDL+GbE+SR-B1（-） 100µmol/L 95.49±16.25 oxLDL+GbE+PI3K（-） 80µmol/L 100.65±15.96 oxLDL+GbE+Akt（-） 25µmol/L 91.87±10.72 oxLDL+GbE+SR-B1（-）+PI3K（-）+Akt（-）idem 56.36±3.88△△

3.讨论

在动脉粥样硬化性心血管疾病中，血栓形成大多是在内皮细胞受损的基础上发生的。内皮细胞在氧化应激或其他致炎因子作用下可合成分泌大量的细胞因子，如TXA2/TXB2以及P-选择素、E-选择素等，参与凝血和血栓形成。因而，保护内皮功能、促进其抗栓功能为血栓性疾病防治的重要措施。

银杏叶中的有效成分黄酮类化合物对冠心病、心绞痛的疗效良好，与降低血脂、改善血液流变性，降低过氧化脂（LPO）、提高超氧化物歧化酶（SOD）活力、清除超氧阴离子自由基等自由基有关；它通过舒张冠状动脉、改善微循环、降低Ca2+内流、抑制血小板聚集等作用，达到保护心、脑血管系统的目的。银杏叶的另一种有效成分银杏内酯是迄今临床上应用最有价值的天然血小板活化因子（PAF）拮抗剂。本实验结果表明oxLDL可使内皮细胞释放TXA2以及P-选择素增加。GbE可抑制oxLDL诱导的TXA2以及P-选择素释放，提示GbE对氧化应激诱导的血栓形成有重要的意义。

OxLDL不仅在氧化应激致动脉粥样硬化过程中起主导作用，还可以通过改变内皮细胞功能参与血栓形成，从而诱导动脉粥样硬化及其所引发的急性冠脉综合征。血管内皮功能调控与NO和eNOS活性密切相关。NO具有松弛血管平滑肌、调节血管张力、调整局部血流、抑制血小板聚集粘附、介导细胞免疫吞噬等作用，在动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等心血管代谢病的发病机制中扮演着重要角色。eNOS诱导产生的NO在心血管代谢病防治方面有重要作用。而高密度脂蛋白通过恢复内皮细胞中被LDL等导致动脉粥样硬化的脂质削弱了的NO合成，间接地抑制了血小板的聚集，以及通过载脂蛋白A-I与B 族Ⅰ型清道夫受体（SR-BI）的结合，高密度脂蛋白还可以活化eNOS，促进一氧化氮合成[4]。本研究采用离体研究的方法，观察暴露于oxLDL环境中内皮细胞eNOS活性的变化。我们的研究结果发现，升高培养基中oxLDL浓度可明显抑制内皮细胞eNOS活性，内皮细胞NO产生减少，同时加入GbE能减弱这种抑制作用，且呈剂量依赖性。而应用信号分子抑制剂干预的研究发现，三种抑制剂均能不同程度地抑制GbE对eNOS活性的增加，进一步证实了GbE经高密度脂蛋白及其受体介导的血管内皮保护作用的细胞内信号通路可能经由PI3K和Akt所介导，提示对SR-B1依赖的PI3K/Akt/eNOS信号途径的促进作用可能是该药及其有效组分抗血栓作用的主要环节。