高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定饲料中7种砷形态化合物

2018-09-29任玉琴饶凤琴

中国饲料 2018年17期

黄娟，任玉琴，饶凤琴

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州 310020）

对氨基苯胂酸、硝羟苯胂酸、卡巴胂等是饲料中常用的药物添加剂，这类添加剂的适量添加具有刺激动物生长，改善畜禽肉质，增加饲料利用率和广谱高效的抗菌等功效。但该类添加剂的过量添加可以使动物中枢神经系统失调，促使脑病和神经萎缩的发病率增高，而且在动物体内的代谢过程中，绝大部分含砷化合物会随粪便排放到环境中，导致土壤中砷元素的蓄积污染，从而对植物尤其是农作物产生毒害作用（张树清等，2005）。因此，饲料中砷的含量及其形态会直接影响畜禽的生长和品质，对土壤环境的安全也具有重要的影响。

目前形态分析主要的方法是色谱与检测系统的联用，包括气相色谱-质谱法（GC-MS）（Roerdink等，2004）、高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法（HPLC-AFS）（肖亚兵等，2014；贺婷婷等，2011；武铄等，2011）和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）法（陆奕娜等，2016；巩佳第等，2014；倪张林等，2013）等，其中以HPLC-ICP-MS的应用最为广泛。HPLCICP-MS法具有检出限低，线性范围宽，适用范围广等优点，目前该技术已被广泛应用于食品（刘崴等，2017；王松等，2016；陈邵占等，2015；杨丽君等，2011；吕超等，2010）、环境样品（刘崴等，2015；刘锋等，2011）中各类砷形态的检测，许锦华（2017）利用该方法对饲料中的亚砷酸盐As（III）、砷酸盐As（V）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜碱（AsB）五种砷形态进行了检测，但对饲料中常用的含砷类药物添加剂并未涉及。本实验拟采用DionexIonPac AS7阴离子交换柱，建立一种有效分离检测饲料中亚砷酸盐As（III）、砷酸盐As（V）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、对氨基苯胂酸（p-ASA）、硝羟苯胂酸（ROX）和卡巴胂（Carbarsone）7种砷形态的HPLC-ICP-MS方法，旨在为饲料的安全评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ICAPQ型电感耦合等离子体质谱仪，美国Thermofisher Scientific公司；U3000型高效液相色谱仪，美国Thermofisher Scientific公司；DionexIonPac AS7阴离子交换柱（250 mm×2 mm）；Milliplus 2150超纯水处理系统，美国Millipore公司产品；旋转蒸发仪，美国BUCHI公司；涡旋仪，德国IKA公司；高压消解罐。

超纯水（电阻率 18.2 MΩ·cm），由超纯水处理系统制备；（NH4）2CO3（分析纯）、甲醇（分析纯），国药集团化学试剂有限公司产品；亚砷酸根离子[As（Ⅲ）]、砷酸根离子[As（Ⅴ）]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）购于中国计量科学研究院；硝羟苯胂酸[洛克沙胂（ROX，98%）]，阿拉丁化学试剂；对氨基苯胂酸[阿散酸（p-ASA，98%）]，西亚试剂有限公司；卡巴胂（Carbarsone），购于TwinbrookPRwy公司；As标准溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心，1000 μg/mL；Bi、Ge、In、Lu、Rh、Sc、Tb、Y 混合内标溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心，100μg/mL；ICAP Q tune B调谐液，Thermofisher Scientific公司。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 DionexIonPac AS7阴离子交换柱（250 mm×2 mm）；流动相 A为 1 mmol/L（NH4）2CO3溶液，B 相为 200 mmol/L （NH4）2CO3溶液；柱温为28℃，进样体积20μL。梯度洗脱程序见表1。

1.2.2 质谱条件入射功率 1550W，雾化器流量1.09 L/min，辅助气流量 0.8 L/min，分析模式KED，采集时间 1200 s。采用ICAPQtune B调谐液对ICP-MS进行优化。由于35Cl和仪器中所用的高纯氩气易形成75ClAr+，干扰75As的测定，因此在总砷的测定中使用干扰方程75As=75M-77M（3.127）+82M（2.733）-83M（2.757）校正多原子离子的干扰，在砷形态分析中同时监测75As、77Se、72Ge、83Kr、35Cl的信号，用以排除35ClAr+的干扰峰（Ronkart等，2007）。

1.3 砷形态分析样品的制备和前处理方法本实验所用样品均来自浙江省兽药饲料监察所抽检样品的留样，取饲料样品过60目筛待用。

称取0.3 g（精确到0.0001 g）饲料样品于50 mL离心管中，加入甲醇-水提取液（1∶1，V/V）10 mL，60℃水浴超声提取2 h，取出冷却，以8000 r/min离心10 min，将上清液转入50 mL鸡心瓶中，向样品残渣中加入甲醇-水提取液5 mL，60℃水浴超声提取0.5 h，取出冷却，以 8000 r/min离心10 min，合并上清液，此操作再重复一次。所得全部上清液转移至旋转蒸发仪50℃减压蒸干，向鸡心瓶中加入超纯水10.00 mL，涡旋溶解，过0.45μm滤膜后，上机测定。

1.4 测定总砷含量的样品前处理方法称取0.3 g（精确到0.0001 g）饲料样品于高压消解罐中，加入5 mL硝酸浸泡过夜。盖好后放入恒温干燥箱，150℃保持4 h。冷却后取出，放在控温电热板上120℃赶去棕色气体，将消化液全部转移并定容至25 mL，用ICP-MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择实验选用DionexIonPac AS19和AS7两种阴离子交换柱进行实验条件的优化，采用AS19作为分析柱时，以200 mmol/L（NH4）2CO3溶液作为流动相，以 0.45 mL/min等度洗脱，在20 min内，ROX未能被洗脱出来，加大流速至0.6 mL/min仍不能洗脱出。选用AS7作为分析柱时，以0.45 mL/min等度洗脱，结果在20 min内，ROX未能被洗脱出来，加大流速至0.6 mL/min，20 min内7种化合物均能被洗脱出来，但各化合物之间不能基线分离。因此试验选择AS7阴离子交换柱作为分析柱，并进一步优化条件。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 流动相的选择选用AS7作为分析柱，以200 mmol/L （NH4）2CO3溶液作为流动相，以0.5 mL/min的流速等度洗脱，As（Ⅲ）和DMA不能完全分离，MMA、p-ASA、 As（Ⅴ）和 Carbarson也不能完全分离。为了实现目标化合物的分离，尝试采用了梯度洗脱，优化后的洗脱程序见表1。在梯度洗脱的条件下，7种砷形态在20 min内可实现完全分离，色谱图见图1。

图1 DionexIonPac AS7作为分析柱，流动相优化后7种砷形态化合物的色谱图（10μg/L）

2.2 样品前处理条件的优化选取生猪饲料一份（S1），实验考察了甲醇+水=1+1（陈邵占等，2015）、1 mol/L H3PO4+0.1 mol/L抗坏血酸（刘崴等，2015）、人工胃液（刘崴等，2017）、水+乙酸=19+1（陈邵占等，2017）四种体系对7种砷形态的提取效果。磷酸溶液作为提取剂，由于饲料样品基质复杂，所测样品的基线过高，方法灵敏度低。对其他3个种类的提取剂，提取次数及提取时间进行了正交试验，以提取的砷形态总和作为监控指标，考察最佳的提取条件，结果见表2。根据提取效率可以看出。提取溶剂最佳的为甲醇+水=1+1，提取时间为2 h，提取温度为60℃，为了确保含砷化合物提取完全，提取次数确定为2次。

2.3 方法的线性范围及检出限分别配制1、5、10、50、100、200、300 μg/L 的 7 种砷形态化合物的混合标准溶液，在优化后的实验条件下进行分析。在上述范围内，线性相关系数均大于0.999。采用逐级稀释的方法考察每种化合物的检出限，7种化合物的检出限（S/N=3）为0.2～0.6μg/L。若称样量为 0.3 g，定容至10 mL，7种砷形态在样品中的最低检出浓度为0.007～0.020 mg/kg，结果见表3。

表2 正交试验方案及结果

2.4 方法的精密度和加标回收率由于未能找到同时存在7种砷形态化合物的饲料样品，因此，平行称取6份生猪饲料（S2），向饲料样品中加入3个质量浓度的7种砷形态化合物的混合标准溶液，按照1.3的方法进行样品的测定，同时考察方法的精密度和加标回收率，结果见表4。

2.5 实际样品的分析利用建立的方法对浙江省饲料企业生产的猪、鸡、鸭、兔、鱼和虾饲料样品中的砷形态进行分析，并采用ICP-MS测定总砷，结果见表5。由表5可以看出，所检测的样品中砷主要以 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）和 DMA 的形态存在，所测样品中无机砷的含量均远远低于GB13078中的限量要求。生猪饲料中检测出了高含量的ASA，砷形态色谱图见图3。HPLC/ICP-MS法检出各含砷化合物的总量均低于ICP-MS法检测的砷总量，说明样品中可能含有其他形态的含砷化合物。

表3 方法的线性范围和检出限

表4 方法的加标回收率和精密度（n=6）

3 结论

本实验建立了HPLC-ICP-MS联用技术同时检测饲料中 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA、p-ASA、ROX、Carbarsone7种砷形态化合物的分析方法。对色谱条件，样品前处理条件进行了优化。采用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）作为提取剂超声水浴提取样品，以DionexIonPac AS7作为分析柱，（NH4）2CO3溶液作为流动相。实验结果显示，7种化合物在20 min内实现基线分离。检测方法的线性范围为1～300μg/L，线性相关系数均大于0.999，检出限为0.2～0.6μg/L，RSD均小于5%，加标回收率为82.3%～104.7%。所建立的方法线性范围宽，准确度和精密度好，能够满足饲料中含砷化合物的测定。