乳酸菌贮存过程中耐湿保护剂的筛选

董佩佩，辛国芹，汪祥燕，刘元香，徐海燕，谷 巍，郑军红

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

益生菌作为一种饲料添加剂在饲料工业和畜禽养殖中得到了广泛的应用，然而益生菌的活力易受贮存时间和贮存条件的影响（李鑫，2011），如乳酸菌对高温、氧气、压力、水分等外界条件敏感（黄沧海，2003；刘亚林，1994），不能抵抗贮存时的不良条件，从而导致其生物活性作用降低，产品质量不稳定。

饲料中耐湿保护剂需要有较强的吸水性能。魔芋是我国的传统食品及医药资源，在现代食品加工业以及工业和医疗保健中具有巨大的开发潜力。以魔芋粉为原料的可食用干燥剂，对纯水的吸收可达到 500～2000倍 （张静和段勇，2004）。海藻糖是由两个葡萄糖分子经α，α-1，1糖苷键连接的非还原性双糖（简文杰等，2003），生物保护作用机制一般认为海藻糖的生物保护机构能够强力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替结合水的功能，从而防止生物体膜和膜蛋白等的变性（黄春秋，2005）。许多研究表明外加海藻糖能够降低冷干过程对细胞膜、脂质体等的伤害作用（潘艳和何胜江，2010；戴秀玉等，2000）。Diniz-Mendes等（1999)研究发现添加外源海藻糖可显著提高酵母细胞的存活率；黄成垠等（1997)研究发现，干燥条件下海藻糖对胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和辣根过氧化物酶等三种医用诊断工具酶的活性具有明显的保护作用。

耐湿保护剂除了要求具有吸水性强外还需要有较强的抗结块作用。抗结剂要求吸湿性强，流动性好，对各种动物无毒、无害，安全可靠（陈文静等，2009；Renniep 等，1999）。 我国许可使用的抗结剂目前有5种：亚铁氰化钾、硅铝酸钠、磷酸三钙、二氧化硅和微晶纤维素。刘仁植等（2015）研究表明亚铁氰化钾可以抑制石材孔隙中氯化钠盐结晶。微晶纤维素是属于半合成高分子化合物，具有纤维素I的晶格特征，结晶度高于原纤维素且具有极强的吸水性，在水介质中经强力剪切作用后具有生成凝胶体的能力。而其也带有许多空隙，由纤维素与水结合，所以具有吸附、保持水等特性（张彩莉和张鑫，2006）。二氧化硅的抗结块机理与微晶纤维素类似（黄英雄和华聘聘，2002）。

本试验立足于益生菌的应用现状，通过在乳酸菌载体中添加耐湿保护剂，筛选出适于乳酸菌贮存的保护剂，减少湿度对乳酸菌活力的影响，从而达到延长其贮存时间的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 植物乳杆菌BLCC2-0001、BLCC2-0015、屎肠球菌 BLCC2-0012、戊糖片球菌BLCC2-0026。

1.1.2 培养基 液体培养基：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 10 g/L、酵母膏 5 g/L、柠檬酸铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾 5 g/L、硫酸锰0.2 g/L、 硫酸镁 0.5 g/L、 吐温-80 1 g/L，pH 6.0，121℃灭菌30 min，接入纯培养的乳酸菌，37℃静置培养 24 h。

乳酸杆菌琼脂培养基（LBS）和乳酸球菌琼脂培养基（EF）为市售。

1.1.3 载体 石粉、玉米淀粉、轻质碳酸钙，比例为 4∶3∶3。

1.1.4 耐湿保护剂 魔芋粉、亚铁氰化钾、磷酸三钙、二氧化硅、微晶纤维素。

1.1.5 试验菌剂 将4株乳酸菌分别接种于液体培养基中，培养好的4株菌液分别于8000 r/min离心10 min，收集菌泥。然后分别与奶粉溶液（奶粉∶蔗糖=25∶8）混匀，冻干机冻干，制得单一益生菌菌剂。

1.2 试验方法

1.2.1 贮存过程中乳酸菌活力的测定 将无保护剂的载体石粉、玉米淀粉、轻质碳酸钙按4∶3∶3比例混合，制成载体，分装于塑料袋中，每袋装100 g；然后将各乳酸菌制剂分别定量添加到载体中，混合均匀，置于温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中，密封保存30 d，定期取样测定载体中乳酸菌活菌数。

1.2.2 单一耐湿保护剂组乳酸菌活力测定 将5种保护剂分别添加到分装的载体中，分别添加定量菌粉，混合均匀。不添加保护剂组为对照组（CK）。置于温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中，密封保存30 d，定期取样测定载体中乳酸菌活菌数。各保护剂添加量分别为魔芋粉2%、亚铁氰化钾0.002%、磷酸三钙2%、二氧化硅1.5%、微晶纤维素2%。

1.2.3 不同保护剂组合添加组乳酸菌活力测定将由单一保护剂筛选得到的效果较好保护剂进行组合添加到分装的载体中，分别添加定量菌粉，混合均匀。不添加保护剂组为对照组（CK）。置于温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中，密封保存30 d，定期取样测定载体中乳酸菌活菌数。各组合中保护剂添加量由单一保护剂添加量进行参考设计正交试验。

1.2.4 混合载体中乳酸菌活菌数的测定 准确称取10 g样品，装入盛有90 mL 0.90%灭菌生理盐水的锥形瓶内，在摇床上振荡30 min，制成1∶10的样品溶液，将此溶液作梯度稀释后，分别吸取1.0 mL稀释菌悬液放入无菌平板中，加入适量相应培养基，充分混匀。每个梯度2个重复，室温下静置5～10 min后，将平板倒置于37℃恒温培养48 h，选取30～300个菌落之间的平板进行计数。

2 结果与分析

2.1 贮存过程对乳酸菌活性的影响 由图1可以看出，在30 d贮存期内，随着贮存时间的延长，各菌株的活菌数有不同程度的变化。4株乳酸菌活菌数对数值 （lg cfu/g）从高到低依次为C2-0026、C2-0012、C2-0001、C2-0015， 分别下降了0.50、2.28、3.95、5.43。 在温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中，戊糖片球菌C2-0026的抗逆性最强，其次是屎肠球菌C2-0012，植物乳杆菌C2-0001、C2-0015的抗逆性较差。

图1 载体中乳酸菌活性随时间的变化

2.2 单一耐湿保护剂对乳酸菌贮存的影响 由图 2 可知，在温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中，4株乳酸菌与不同保护剂混合贮存过程中活菌数变化差别较大，但各保护剂对菌株的死亡均有一定的延缓作用。微晶纤维素和魔芋粉对乳杆菌C2-0001和C2-0015在高湿度条件下贮存起到一定的保护作用，效果好于二氧化硅和亚铁氰化钾，贮存30 d存活率均比对照组高3%左右，另外磷酸三钙对C2-0015的保护效果也较好。

二氧化硅和魔芋粉对球菌C2-0012和C2-0026在高湿度条件下贮存能够起到保护作用，其效果好于其他3种保护剂。对于C2-0012，贮存30 d二氧化硅组和魔芋粉组活菌数与其他组差异显著，分别比CK组高0.75、0.81 lgcfu/g。对于BLCC2-0026，魔芋粉对菌株的保护作用显著，贮存30 d活菌数比对照组高0.20 lgcfu/g。

图2 4株乳酸菌与不同保护剂混合活菌数随贮存时间变化

2.3 不同保护剂组合对乳酸菌贮存的影响 由单一保护剂对乳酸菌贮存影响试验中筛选到魔芋粉、二氧化硅、磷酸三钙和微晶纤维素4个重要因素作为研究对象，选用4因素3水平L9正交表，以贮存22 d活菌数为指标通过正交试验来寻求各保护剂之间最佳配比。将BLCC2-0012菌粉与各组合配方分别添加到载体中，混合均匀，置于温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%的环境中密封保存，定期取样计数。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平%

表2为贮存22 d活菌数的结果，活菌数极差R分析结果表明RC＞RB＞RD＞RA，即各因素主次关系为磷酸三钙＞二氧化硅＞微晶纤维素＞魔芋粉。BLCC2-0012最佳耐湿保护剂组合为A3B2C3D3，即最佳耐湿保护剂组合为魔芋粉1%、二氧化硅1%、磷酸三钙2%、微晶纤维素2%。验证试验结果表明，相同温湿度条件下，相同添加量BLCC2-0012菌粉，该组合保护剂中贮存22 d活菌数为9.50 lg cfu/g。

表2 正交试验结果

3 结论

本研究中4株乳酸菌对同一温湿度环境的抗逆性不同，2株球菌的抗逆性强于两株杆菌，球菌中戊糖片球菌C2-0026对湿度的抗逆性强于屎肠球菌C2-0012。在贮存过程中，各保护剂对菌株的死亡均有一定的延缓作用，但不同保护剂对不同菌株的保护作用略有差异。微晶纤维素、魔芋粉和磷酸三钙对乳杆菌C2-0001和C2-0015在高湿度条件下贮存的保护作用优于二氧化硅和亚铁氰化钾，二氧化硅和魔芋粉对球菌C2-0012和C2-0026在高湿度条件下贮存的保护作用优于其他三种保护剂。将魔芋粉、二氧化硅、磷酸三钙和微晶纤维素作为正交试验的4个考察因素，进行L9（34）试验设计结果表明，屎肠球菌C2-0012最佳耐湿保护剂组合为魔芋粉1%、二氧化硅1%、磷酸三钙2%、微晶纤维素2%，在初始添加量为 5.0×109cfu/g，温度为（28±0.5）℃，湿度为（70±2）%条件下贮存22 d，贮存载体中C2-0012活菌数为3.17×109cfu/g，存活率为63.40%，而未添加保护剂组相同条件下贮存22 d，存活率为16.04%，筛选得到的配方中C2-0012存活率提高47.36%。