脱氢异雄酮缓解急性肺损伤及其机制研究

白植宽，高晓慧，冯 涛

0 引言

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是一种以肺泡毛细血管膜受损为特征的异质性疾病，由于通透性增加而引起肺水肿增加，并可直接或间接发生肺部炎症[1-2]。ALI最常见的直接病因是实质性肺部感染(即肺炎)或出血，而间接病因通常是全身性损伤，如败血症、创伤或急性肾损伤[2-3]。然而，ALI的具体发病机制尚未完全阐明，目前缺乏有效的治疗手段，研究显示，NADPH氧化酶(NOXs)激活产生的活性氧(ROS)在ALI的发病过程中起着重要的作用[2,4]。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)可将NADP+还原成NADPH，是调节细胞中氧化还原平衡的关键酶[5]，其不仅提供了NADPH氧化酶的还原当量，还减少了ROS。在细胞产生ROS的酶体系中，研究最多的是NOX2。NOX2主要存在于嗜中性粒细胞等吞噬细胞中，在气道上皮细胞(AECs)也有表达[4,6]。然而，关于ALI期间G6PD对AECs中NOX2-衍生的ROS作用的研究还较少。由于ROS在ALI过程中起重要作用，我们推测G6PD活性可能通过NOX2调节AECs中ROS的通量发挥。

脱氢异雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是一种G6PD抑制剂，研究证实，DHEA及其代谢产物具有抗炎、抗增殖和免疫调节活性[7-8]。因此，我们研究DHEA对LPS诱导的小鼠模型中G6PD活性、NOX2表达、ROS和AEC中酶抗氧化剂的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 LPS、DHEA(美国Sigma公司)；RNeasy微型试剂盒(德国Qiagen公司)；逆转录试剂、Taqman Universal Mastermix、7500实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)；蛋白定量试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色剂、DCFH-DA检测试剂盒(南京建成生物)；多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；多模式微板荧光分光光度计(BMG LabTech)。

1.1.2 实验动物 实验中使用在无特定病原体条件下饲养的雄性Balb/c小鼠(鼠龄10～12周，体重25～30 g)，由温州医科大学药学院动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 LPS小鼠模型的建立及分组 参照文献[9]造模方法，应用异氟醚轻度麻醉小鼠，每只小鼠于鼻内接受单剂量的LPS(50 μg/50 μl)。对照小鼠鼻内给予等体积生理盐水。每只小鼠给予200 μg DHEA，评估G6PD抑制对小鼠LPS诱导的肺部炎症的影响。将小鼠随机分成4组，每组8只。对照组(Con组)：小鼠仅接受生理盐水；LPS给药组(LPS组)：小鼠鼻内给予LPS；G6PD抑制剂DHEA和LPS处理组(DHEA+LPS组)：小鼠接受DHEA和鼻内LPS。G6PD抑制剂DHEA处理的对照组(DHEA+Con组)：小鼠接受DHEA和鼻内生理盐水。

1.2.3 组织病理学分析 收集肺组织，10%福尔马林固定，将石蜡包埋的组织切成5 μm切片，HE染色，通过光学显微镜分析染色。

1.2.4 G6PD及葡萄糖还原酶(GR)活性检测 使用BioVision试剂盒测量G6PD活性。参照Carlberg等[10]的方法测量气管上皮细胞的GR活性，于340 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 RT-PCR检测 用DNA酶处理的RNeasy微型试剂盒提取气管上皮细胞的总RNA。根据逆转录试剂说明书，从0.5 μg总RNA合成cDNA。对于编码NOX2、SOD1、SOD2、GPx1、G6PD、18S rRNA(核糖体RNA)的基因，使用Taqman Universal Mastermix、cDNA和FAM标记的基因特异性引物进行RT-PCR。将每个靶基因的数据标准化为内源对照基因，并使用2-ΔΔCT分析。

1.2.6 流式细胞仪 采用免疫染色方法即FITC/APC/PE标记的抗体对CD326、NOX2、硝基酪氨酸或SOD1进行表面/细胞内标记。在流式细胞仪上检测染色的细胞，并使用FLOW JO分析目的蛋白质的表达。

1.2.7 ROS测量 参照Wang等[11]的方法，使用荧光染料2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA;100 μmol)和多模式微板荧光分光光度计测量上皮细胞中的ROS。

2 结果

2.1 G6PD抑制剂对LPS诱导的ALI的影响 LPS可以增强气道炎症(总白细胞/中性粒细胞、MPO活性和组织病理学)和通透性(BALF总蛋白浓度、肺泡-毛细血管渗漏)。DHEA可以改善LPS诱导的气道炎症和通透性。由于DHEA处理和未处理的对照小鼠之间差异无统计学意义，未对这个小组进一步分析。结果表明，抑制G6PD可以减弱LPS诱导的气道炎症。见图1。

2.2 LPS对AECs G6PD表达/活性的影响及DHEA的调节作用 由于氧化炎症(ROS产生及其清除)依赖于G6PD的活性和表达，因此，我们在ALI期间评估其在AEC中的表达和活性。结果表明，在LPS诱导的ALI期间，G6PD显著升高。然而，G6PD抑制剂DHEA将G6PD的活性归一化而不影响其表达。DHEA处理后，AEC中G6PD活性降低，导致LPS诱导的气道炎症/通透性降低。见图2。

2.3 LPS对AECs中NOX2表达/ROS产生的影响及DHEA的调控作用 NOX2衍生的ROS产生涉及不同的ALI模型，本研究中，我们探索在小鼠模型中ALI与AECs中G6PD和ROS产生的关系。RT-PCR和流式细胞术结果显示，LPS在AEC中诱导NOX2增加(图3A、B、D)。LPS给药后，AEC中ROS产生显著增加(图3C)。G6PD的抑制作用不能改变NOX2的表达，但是由于NADPH的供应受到限制(图3A～D)，导致ROS产生减少。结果表明，在ALI期间，NOX2-衍生的ROS在AEC中升高，可能受G6PD活性的控制。

图1 DHEA对LPS诱导的小鼠气道炎症及相关参数的影响

注：A.BAL总白细胞，B.总BAL中性粒细胞，C.肺MPO活性，D.BALF蛋白质浓度，E.组织病理学分析，通过HE染色肺组织切片(上图;100×)和BAL差异白细胞计数(下图;100×)。与LPS组比较，*P<0.05

图2 LPS对G6PD表达/活性的影响及G6PD抑制剂DHEA的调节作用

图3 DHEA对LPS诱导的小鼠AECs NOX2表达和ROS产生的影响

注：A.NOX2 mRNA表达，B.NOX2+EpCAM+细胞，C.ROS产生，D.EpCAM+细胞中NOX2免疫染色的代表性点图。与LPS组比较，13:45 2018/9/28

2.4 LPS对AECs抗氧化酶的影响及DHEA的调节作用 结果表明，在给予LPS后，AECs中SOD1的mRNA表达增加(图4A)，表明ROS主要诱导AECs中的SOD1。在ALI过程中，AECs中SOD1的表达增加(图4A、B、E)。上调SOD1表达伴随着硝基酪氨酸表达的增加，这是LPS处理小鼠中过氧亚硝酸盐介导的氧化损伤的标记(图4D、F)。用DHEA治疗小鼠ALI导致SOD1的正常化和AECs中的硝基酪氨酸表达(图4A、B、D、F)。同时，LPS诱导的ALI导致AECs中GR活性降低(图4C)。结果表明，上调SOD1和降低GR活性可能导致ALI期间的氧化损伤和炎症；G6PD活性的抑制使AECs中LPS诱导的氧化剂-抗氧化剂失衡正常化，提示抑制G6PD的同时，可以抑制ALI相关气道炎症/通透性。

3 讨论

NADPH氧化酶、G6PD在调节氧化还原平衡以及脂质/胆固醇合成中起关键作用。在某些炎症条件下，由于NADPH供应增加，G6PD过表达，导致NOX2衍生的ROS增加[5,12]。结果表明，上调的G6PD可能是组织炎症的介质之一。因此，为了研究G6PD在LPS诱导的气道炎症中的病理生理作用，本研究选择G6PD抑制剂DHEA。结果显示，G6PD抑制导致气道炎症减少，这可能是由于ALI LPS模型中AECs中NOX2衍生的ROS产生减少。在几种肺部疾病(如急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、哮喘和囊性纤维化)的发病中，都涉及ROS的大量产生。ROS可以从常规来源如嗜中性粒细胞释放，通常涉及膜结合NOX2以及胞质成分的激活[6]。NOX2在肺系统中的过度表达产生ROS，NOX2产生的ROS介导ALI肺组织的氧化损伤[6]。AEC通过NOX2产生ROS[6,13]，然而，在LPS诱导的ALI过程中，G6PD在AECs中调节NOX2介导的ROS中作用的研究还较少。

研究表明，G6PD缺乏症与氧化应激和炎症有关，其提供还原ROS的还原当量[5,14]。本研究结果表明，AECs中的G6PD活性随着NOX2介导的ROS产生增加，可能导致ALI相关的肺部炎症。有报道，NADPH氧化酶供应增加导致氧化应激的G6PD活性增加[15]。LPS诱导的急性肾损伤研究显示，其可提高G6PD活性，导致肾功能障碍[16]。炎症信号如IL-1β可以通过增加磷酸戊糖和来自NOX2的ROS引起高血糖相关的血管损伤[17]。

图4 DHEA对LPS诱导的小鼠AECs SOD1和硝基酪氨酸表达的影响

注：A.SOD1 mRNA表达，B.SOD1+EpCAM+细胞，C.GR活性，D.硝基酪氨酸+EpCAM+细胞，E.EpCAM+细胞中SOD1免疫染色的代表性点图，E.EpCAM+细胞。与LPS组比较，*P<0.05

上述研究结果与本研究一致，有报道，ALI兔模型中G6PD活性增加，但是并没有研究在ALI过程中G6PD抑制是否有益[18]。本研究结果显示，G6PD抑制导致ROS和气道炎症减少。Vimercati等[19]研究表明，由于氧化应激减少，在衰竭心脏中抑制G6PD有益处。因此，抑制G6PD和ROS减少可能是减轻气道炎症的一个因素。本研究中，AECs中ROS和硝基酪氨酸的显著升高被DHEA阻断，提示G6PD活性升高加剧了肺部氧化炎症，这可能是由于NOX2产生了过量ROS。

本研究结果显示，总的BALF蛋白质浓度下降时，伴随着ROS生成减少。结果表明，由于抑制G6PD导致ROS产生减少，可能是造成肺血管通透性总体下降的原因。依赖于LPS处理的小鼠AEC中G6PD活性增强和GR活性降低导致来源于NOX2的ROS产生增加。DHEA抑制G6PD活性导致气道炎症/通透性降低，说明G6PD可能是治疗干预的新靶点，可减少NOX2氧化应激，改善ALI期间的肺部炎症。