肾移植穿刺标本冰冻切片制作方法及体会

余鑫鑫，陈阳，阎红琳，袁静萍

（武汉大学人民医院1病理科，2麻醉科，武汉 430060）

冰冻切片是病理科的急诊工作，要求病理医师在很短的时间内做出正确的诊断，为手术医生下一步的手术方案提供指导。在肾移植手术中，影响肾移植效果的因素有很多，如排斥反应、各种并发症导致的损伤等[1]，这就要求临床医生对供肾功能状态进行评估，除临床评分及肉眼评估外，病理活检是评估移植肾功能，预测器官分配或远期存活的金标准[2]。临床将供肾穿刺标本取出送病理科进行快速病理活检，而冰冻切片质量的好坏直接决定诊断的快速、客观、准确、合理，因此，一张快速优质的供肾穿刺标本冰冻切片显得尤为关键。肾穿刺标本比较柔嫩细小，在冰冻切片制片过程中常出现切片缺损、褶皱、刀痕、裂隙、染色不均、对比度差等问题，给制片和诊断带来一定困难，为解决上述问题，作者经过10例供肾穿刺标本的实践摸索，总结出切片和染色质量既快又好的肾移植穿刺标本冰冻切片制作方法，现介绍如下。

材料与方法

1 材料

1.1 研究对象

选取2017年武汉大学人民医院手术室提供的10例肾移植供体穿刺标本。

1.2 仪器与试剂

德国Leica CM1950恒温冷冻切片机，温度处于（-25～ -20）℃；爱华牌烤片机，温度处于（65～70）℃；普通胶水；新鲜Harris苏木素染液；1%盐酸酒精；0.5%氨水；各级梯度酒精；环保透明液；中性树胶；1%醇溶性酸化伊红染液：1g醇溶性伊红、100ml 95%乙醇、加几滴冰醋酸至半透明状；改良AFA固定液：无水乙醇75ml、40%甲醛10ml、丙酮 10ml、冰醋酸 5ml。

2 方法

2.1 两步法包埋

接收到肾穿刺标本后，首先在样本托上，均匀涂抹一层普通胶水，再将样本托放置于冰冻切片机冷冻锤下，轻轻压平成型半分钟，取出样本托，将标本平铺成一条直线放于样本托上；其次在放置好的标本上，均匀涂抹一层普通胶水，至全部覆盖标本，并用冷冻锤轻轻压平成型1min，这样既能将组织垫高，又能使组织平整，便于组织切全（图1）。

图1 两步法包埋操作步骤Fig. 1 Two-step embedding procedure

2.2 先粗修再细切方式切片

标本冷冻完成后，首先将样本托固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其恰好位于切片刀的后方，其次将切片厚度调至最小厚度1μm，左手按一下前进键，随即右手沿逆时针方向缓慢均匀地将手柄从最高点转动1/4圈后回位，使标本由上至下均匀在切片刀口上完整刮过一次，以此粗切削的方式进行标本的粗修至暴露出标本的最大平面。然后将切片厚度调为3μm进行细切，右手顺时针匀速转动手柄，清除头两张切片和平台上的组织碎屑，随手柄的匀速转动，左手持毛笔轻带组织下方的白边（普通胶水冷冻后形成的白色固体），使切片从下至上完整平坦的展开，右手持载玻片轻轻平稳地压下组织，使其平整地吸附在载玻片上，迅速放入固定液固定。

2.3 改良AFA固定液固定与HE染色

切片完成后迅速放入改良AFA固定液中固定30s。稍水洗终止固定，然后将切片放置于烤片机支架上，均匀滴加苏木素染液，染色半分钟（春夏季半分钟，秋冬季1min），稍水洗，1%盐酸酒精分化1～2s，稍水洗终止分化，0.5%氨水反蓝5s，稍水洗，均匀滴加酸化伊红染液，染色5s，稍水洗，依次各级梯度酒精脱水，环保透明液透明，中性树胶封固。显微镜下观察。

3 冰冻切片及HE染色评判标准

切片应组织完整，无明显缺损、褶皱、刀痕、裂隙。染色应全片透明度好，颜色深浅适度，色彩鲜艳，红蓝对比鲜明，无偏色；苏木素染细胞核应核膜、核仁清晰，胞质和纤维均无苏木素共染现象；伊红染胞浆应细胞膜、细胞质粉红色，层次分明。

结 果

10例肾移植供体穿刺标本通过显微镜下观察：切片组织完整，大部分切片无缺损、褶皱、刀痕、裂隙；HE染色显示颜色深浅适度，色彩鲜艳，核膜、核仁染色清晰，与胞浆染色红蓝对比鲜明，无偏色，对比度好（图2）；制片时间11.5～14min，平均制片时间12.9min（表1）。

讨 论

肾移植穿刺标本组织量较少，而且在处理过程中易断裂、破碎、丢失，因此在快速制片的每一个环节都应谨慎处理，作者收集10例肾移植穿刺活检组织标本，在组织的冰冻温度设定、包埋、切片、固定、染色方面总结出一套既保证切片质量又快速的制片方法。

图2 肾移植穿刺标本冰冻切片HE染色。比例尺，50μm。Fig. 2 HE staining of frozen section of renal transplantation needle biopsy specimen. Scale bar, 50μm

表1 10例肾移植供体穿刺标本冰冻切片染色结果Tab. 1 HE staining results of 10 cases of renal transplantation needle biopsy specimen frozen section

1 冰冻切片的温度设定

肾移植穿刺标本直径一般在1～2mm，长度一般为5～20mm[3]，组织柔软稚嫩，对切片温度有很高的要求，温度过低容易使穿刺组织硬度过大，切片时组织呈碎屑状，而温度过高又使组织的硬度不够，使切片不能成形[4]。根据我们在穿刺组织冰冻切片中的经验，本研究将肾移植穿刺标本的冰冻切片机温度调在（-25～ -20）℃之间，切片效果良好。

2 包埋

传统的大组织在进行冰冻切片时往往无包埋步骤，而肾脏穿刺组织较小呈细条状且很珍贵，为使切片平坦完整，在制作冰冻切片过程中作者用两步法包埋组织，首先在样本托上用普通胶水冻制一个平整的小冷台，将组织放在小冷台上平铺成一条直线，这样既可使组织垫高，又可防止因组织过小切片过度，刀刃切到样本托而造成刀片和机器损伤[5]；其次再用胶水将组织全部覆盖，于冷冻锤下轻轻压平，对标本完成双面包埋，利于后续切片的平坦及完整。已有研究显示普通胶水可替代进口OCT包埋剂用于冰冻切片的包埋，且在多种组织上取得很好的效果[6]，我科从2015年至今一直使用普通胶水作为冰冻切片的包埋剂，既节约成本，效果又很理想。

3 切片

本研究采用先粗修再细切的切片方法，粗修至暴露出组织最大面，以保证组织切全。粗修时一定要谨慎小心匀速进行，将切片厚度调为最小，以免因粗心大意或速度过快导致粗修过度而造成珍贵组织的缺损甚至丢失。组织修出最大面即停止粗修，将切片厚度调为3μm，因为组织细胞内含有水分，在（-25～ -20）℃的温度下，组织细胞会发生膨胀，调大切片厚度为3μm以保证在同一横截面切出最多的细胞。

4 固定

改良AFA固定液已被作者研究在冰冻切片固定中有优于其它固定液的表现[7]，其成分包括无水乙醇、甲醛、丙酮、冰醋酸，混合后立即使用。纯酒精的脱水作用比较强，但硬化组织快，对组织有明显的收缩作用；甲醛穿透力强，固定均匀，能增加组织的韧性；冰醋酸虽不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白，对细胞核固定效果好，也能使组织膨胀；丙酮能迅速固定蛋白质，穿透力极强，进一步缩短固定时间。丙酮跟冰醋酸都能使组织膨胀，联合应用既能抵消酒精固定所引起的组织高度收缩和硬化，又能加速固定，兼备快速脱水和固定作用[8]。因此切片经改良AFA固定液固定能提高固定效果，缩短固定和脱水时间。

5 染色

在伊红染色液的配制过程中，作者加入适量的冰醋酸，其目的是为了增强组织细胞的染色力。伊红是一种酸性红色细胞质染料，在溶液中电离带负电，易与带正电荷的细胞质结合而使其染色。细胞质的等电点为pH4.7～5.0，在伊红染液中加入冰醋酸就是把pH值调到细胞质等电点pH4.7以下，促使胞质中的蛋白质发生碱式电离带正电，易与带负电的酸性染料伊红结合在一起[9]，进一步缩短染色时间。

结合以上冰冻切片机温度选择，普通胶水使用，两步法包埋，改良AFA固定液固定以及HE染色中酸化伊红的应用，大大提高了肾移植穿刺标本冰冻切片的质量和制片速度，很好的服务了肾移植患者，具有临床实用价值，值得推广。