低浓度乙醇激活乙醛脱氢酶2抑制糖尿病大鼠心肌中自噬相关蛋白的上调

陶敏，康品方，郭建路，孙硕，许洪铭，高琴，唐碧，张恒*

（1蚌埠医学院第一附属医院心血管科，蚌埠，233004；2蚌埠医学院临床医学系，蚌埠，233030；3蚌埠医学院生理学教研室，蚌埠，233030）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是一种独立的糖尿病并发症，其发病机制复杂，可能涉及代谢紊乱、心肌纤维化、氧化应激、线粒体障碍、微循环病变、胰岛素抵抗等多种因素。主要临床表现为心脏舒缩功能障碍，可诱发心力衰竭、心律失常、心源性休克及猝死等。如何预防DCM的心血管并发症，降低DCM的致死风险成为了临床医生和科研工作者关注的重点。

线粒体乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是一种在心脏中高度表达的线粒体酶，已经成为心脏保护中的关键酶，因为它不仅在乙醇脱氢酶产生的乙醛的解毒中起主要作用，而且还可以代谢氧化应激过程中产生的其他醛类，如脂质过氧化产物等[1]。我们前期研究观察到，长期低浓度乙醇可激活ALDH2发挥心肌保护作用[2]，ALDH2的表达减弱可降低心肌抗氧化能力加重糖尿病心肌损伤[3]，但其具体的机制仍有待于进一步探讨。

越来越多的研究表明，自噬参与并影响着各种心血管应激和心脏疾病的发生发展[4]。自噬是细胞消化降解溶酶体中的受损蛋白质和细胞器的过程，是维持细胞基础代谢必不可少的生理过程。而自噬在糖尿病心肌损伤中的作用是具有高度争议的，一些研究表明自噬在糖尿病心肌损伤中是减少的，另一部分研究则是相反的[5]。Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，可用来检测自噬发生的程度。心肌细胞中的自噬水平受到缺血再灌注损伤的影响，而上调beclin-1的表达水平可增强自噬，起到细胞保护作用，beclin-1表达的变化可反映细胞代谢的情况[6]。

研究可观察到，ALDH2的表达降低可以改变细胞内Ca2+的稳态、上调自噬及损害线粒体功能，从而加重酒精引起的心肌损伤[7]。本实验旨在探讨高糖状态下ALDH2对心肌细胞自噬水平的影响，及beclin-1介导的自噬水平的改变在ALDH2保护心肌损伤中的作用，进一步分析其可能机制。

材料和方法

1 复制糖尿病心肌损伤模型

雄性SD大鼠20只，适应性喂养1周，随机分成正常组（CON，n=6）和实验组（n=18）。实验组禁食12h后单次腹腔注射链脲佐菌素（60mg/kg），72h后尾静脉采血测大鼠空腹血糖，以≥16.7mmol/L并持续1周为模型复制成功。将成功模型分成糖尿病组（DM）和酒精干预组（DM+EtOH）。CON组和DM组给予常规饮食饮水，DM+EtOH组在造模成功的基础上先给予2.5%乙醇日常饮用1周，后改为5%乙醇继续喂养至10周。

2 大鼠心体比

测禁食12h后的大鼠体重（g），实验结束后称取大鼠心脏重量（mg），心脏重量与大鼠体重的比即为心体比。

3 大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量变化

在冰上将称取的0.1g心肌组织制成10%组织匀浆，3000r/min离心15min后取上清，按试剂盒说明书以酶标仪分别测定心肌组织SOD活性及MDA含量。

4 免疫组织化学染色

将正常大鼠心脏及糖尿病大鼠心脏组织标本经过固定包埋、切片、抗原修复，加入显色剂等一系列处理后晾干。在显微镜下观察，选择实验组和对照组的阳性和阴性组织显微照相并进行图像分析。评分标准即IHS=A×B（A表示阳性细胞数分级，B表示阳性细胞显色强度分级）。

5 Masson染色

石蜡切片脱蜡复水，按照试剂盒说明进行染色，冲洗，待晾干后封片，显微镜下观察读片。

6 Western blot检测

取0.1g心肌组织进行裂解获取组织匀浆，4℃离心（12000r/min，15min），取上清，蛋白定量后，经15% SDS-PAGE分离，随后，电转膜至PVDF膜，先后加入抗beclin-1、微管相关蛋白1轻链3 B亚基（B subunit of microtubule-associated protein1 light chain 3, LC3B）、B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B19KD相互作用蛋白3（Bcl-2/ adenovirus E1B19KD interacting protein 3，BNIP3）或β-actin一抗，4℃过夜。次日洗涤并加入HRP标记的二抗孵育，ECL试剂盒进行曝光成像。凝胶成像系统进行条带的光密度测量，计算目的蛋白与β-actin蛋白表达的相对量。

结 果

1 乙醇干预抑制糖尿病大鼠的心重与体重的降低

与CON组相比，DM组、DM+EtOH组大鼠心重（heart weight, HW）、体重（body weight, BW）明显减轻，而心体比（H/B）显著增加；对糖尿病大鼠进行乙醇干预后，心重和体重的降低与心体比的增加被明显抑制（表1）。

2 乙醇干预减轻糖尿病大鼠心肌组织SOD活性降低和MDA含量增加

与CON组相比，DM组SOD活性明显降低，MDA含量明显增高，提示心肌氧化应激损伤加重；与DM组相比，DM+EtOH组的SOD活性降低和MDA含量增加显著减轻，提示氧化应激损伤减轻（图1）。

表1 大鼠心重、体重和心体比比较Tab. 1 Comparison of heart weight, body weight, and heart-to-body weight ratio of the rats

图1大鼠心肌组织SOD活性和MDA含量变化检测. A，SOD的活性；B，MDA的含量；与正常组比较：**P＜0.01；与糖尿病组比较：##P＜0.01；n=6Fig. 1 Analysis of SOD activity and MDA content in the rat myocardial tissues. A, SOD activity; B, MDA content. Compared with CON group,**P＜0.01; compared with DM group ,##P＜0.01; n=6

3 乙醇干预抑制糖尿病大鼠心肌组织中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反应性的增强

与CON组相比，DM组大鼠心肌组织中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反应性明显增加，乙醇干预显著抑制糖尿病大鼠心肌组织中beclin-1、LC3B和BNIP3免疫反应性明显的增加（图2）。

4 乙醇干预减轻糖尿病大鼠心肌组织纤维化

Masson染色显示，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色。CON组心肌排列整齐且分布均匀，胶原纤维散在分布或呈条索状；DM组胶原纤维粗大，交织成网状或堆积成片状，排列分布不均匀，沉积增多，提示心肌纤维化程度增加；DM+EtOH组胶原纤维较前有所改善，沉积减少，提示心肌纤维化程度有所减轻（图3）。

5 乙醇干预抑制糖尿病大鼠心肌组织中ALDH2的减少和beclin-1、LC3B与BNIP3水平的增加

Western blot检测显示，与CON组相比，DM组ALDH2水平明显减少，而beclin-1、LC3B和BNIP3明显增加，乙醇干预的糖尿病大鼠（DM+EtOH组）中，ALDH2水平的减少和beclin-1、LC3B与BNIP3水平的增加明显少于单纯糖尿病大鼠（图4）。

讨 论

图2大鼠心肌组织中beclin-1、LC3B和BNIP3水平的免疫组织化学检测。A，代表性免疫组织化学染色（比例尺，100µm）；B，免疫反应性变化的统计学分析（与正常组比较：**P＜0.01；与糖尿病组比较：##P＜0.01；n=6）Fig. 2 Immunohistochemical examination of beclin-1, LC3B and BNIP3 levels in rat myocardial tissues. A, representative immunohistochemical staining (scale bar, 100µm); B, statistical analysis of the immunoreactivities; compared with CON group(**P＜0.01; compared with DM group, ##P＜0.01;n=6)

图3 大鼠心肌组织胶原纤维变化的Masson染色检测。比例尺，100µmFig. 3 Masson staining of collagenous fi bers in the rat myocardial tissue. Scale bar, 100µm

图4大鼠心肌组织中ALDH2、beclin-1、LC3B和BNIP3水平的Western blot 检测。A，代表性Western blot；B，Western blot 的统计学分析（与正常组比较：**P＜0.01；与糖尿病组比较：##P＜0.01；n=6）Fig. 4 Western blot detected the expression of ALDH2, beclin-1, LC3B and BNIP3 in myocardial tissue of rats. A, representative Western blot; B,statistical analysis of Western blot results; compared with CON group, **P＜0.01; compared with DM group ,##P＜0.01; n=6

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是一种独立的疾病，心肌肥厚和心肌纤维化是其主要的病理表现。长期高糖状态可导致心肌细胞代谢异常，心肌纤维化加重及心脏收缩舒张功能障碍。ALDH2作为一种代谢乙醛和毒性醛的酶，与多种心血管疾病的发生发展密切相关，如冠状动脉疾病、缺血再灌注损伤、糖尿病性心肌病和心功能不全[8,9]。当长期处于高血糖状态时，ALDH2的活性下降，糖尿病心脏中4-HNE化合物的形成增加[10]。

糖尿病心肌损伤过程中伴随着氧化应激的发生，氧化应激状态会导致线粒体、内质网、溶酶体等细胞器损伤、脂质过氧化，细胞内自噬水平过度增加[11]，引起线粒体水肿、线粒体嵴断裂等损伤，细胞内能量供应不足，进一步加重细胞损伤[12]。细胞中的能量主要来源于线粒体，当线粒体受到损伤，能量供应发生障碍时，一定程度上的自噬激活有助于维持细胞的正常活动。研究发现，细胞内自噬激活与ROS等氧化产物的增加密切相关[13]。在糖尿病心肌病时氧化应激会更加显著[14]。本实验中，DM组H/B、MDA含量增加明显，SOD活性下降，心肌纤维化程度加重，而当给予ALDH2激动剂乙醇干预后，大鼠H/B、MDA含量、心肌纤维化程度均降低，SOD活性下降明显减轻，提示糖尿病心肌损伤时心肌氧化应激增加，心肌纤维化加重，激活ALDH2表达后氧化应激和心肌纤维化程度均降低。

自噬与糖尿病心肌病的关系近年来受到越来越多的关注。研究表明，自噬不仅发生在基础条件下健康的心脏中，也发生于病理条件下，包括心力衰竭、心脏肥大、缺血性心肌病、急性心肌梗死、心室重构等疾病的发生发展过程中，这表明自噬在维持心脏功能的过程中起着重要作用[15,16]。大量研究证实在心室重塑早期，自噬对心肌细胞具有一定的保护作用[17]。Beclin-1在调节自噬和自噬与凋亡的各个步骤的调节中发挥关键作用[18]。研究发现，在OVE26诱导的1型糖尿病心肌病小鼠中，beclin或者自噬相关基因At96过表达时，自噬上调，伴有心功能的更大损伤。当beclin-1或At96缺失时，自噬减少，心功能改善。同时有研究证实激活AMPK和增强beclin-1的表达在心肌细胞缺血缺氧时可诱导自噬增强起到心肌保护作用[19,20]。研究发现，2型糖尿病可通过beclin-1的激活增加心脏心肌细胞自噬[21]。有趣的是，在我们的实验中观察到，DM组大鼠心肌组织中ALDH2表达减少，自噬标志物beclin-1、LC3B、BNIP3表达增加，而乙醇干预可显著抑制这些变化，提示糖尿病心肌损伤过程中有自噬的激活现象发生，且这一现象的发生与beclin-1蛋白表达的增强密切相关。

综上所述，ALDH2可通过减轻心肌氧化应激、抑制心肌纤维化、减少自噬发挥糖尿病心肌损伤保护作用，这一现象可能与ALDH2抑制beclin-1表达有关。自噬在糖尿病心肌损伤中发挥作用的机制比较复杂，具体机制有待于更进一步明确，从而为临床治疗糖尿病心肌损伤提供新的治疗思路。